Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing（Nature biotechnology | 2016.02）

本文研究人员基于10x Genomics平台，用1ng DNA来定相、细胞分型和肿瘤基因组测序。研究人员无需父亲、母亲及孩子(trio)的测序信息即可确定变异间的顺式或反式关系。研究人员通过定相的外显子测序检测NCI-H2228癌细胞系的EML4-ALK重排，从原发性结腺癌的全基因组测序产生的特定碱基规模单倍型检测到遗传变异。这种方法在使用少于100套染色体基因组DNA的条件下获得了单倍型信息，并且实现了结构变异的##检测。

全基因组linked reads测序

本研究评估了linked reads测序在单倍体分型中的性能。研究人员依靠三个组成一个核酸三体的热图样本：NA12878 (mother)、NA12877 (father)、NA12882 (child)。这些样本已经有实验上的定相和由遗传模式导出的单体型统计。

基于10x Genomics建立barcode测序文库，用Illumina Hiseq 2500进行2×98双端测序。总体文库质量高，>95%的reads比对成功，一次至少覆盖>90%的基因组，并且大部分缺口短于50kb，PCR重复率极低。文库插入片段大小约200bp。

研究人员基于linked read概念，从对照基因组实验上推出，单倍体类型的数据可以判断DNA长度、单倍体分型和识别DNA结构变异。通过该方法，研究人员在30×测序下SNV的检出敏感度达到0.93，阳性预测值0.99。

生殖细胞结构变异定相的发现

用传统的短读测序很难发现结构突变，尤其是在基因组高重复区。作者用linked-read数据在大规模SVs中检出断点，并分配他们到特殊的单倍体型。

图1 NA12878中基因确实检测

a, b: linked-read分析可以区分真SV和假阳性的假定断点。c: 8个在NA12878识别和验证的长基因组缺失候选片段，长度超过70kb。其中五个比较有意义，且定相于两端缺失，三个缺失可以由母亲遗传给孩子。

通过外显子组定相对EML4-ALK重排进行检测

作者使用定相的外显子测序研究NCI-H2228癌细胞系的EML4-ALK基因融合的结构，检测出临床癌症重排。

图2 NCI-H2228癌细胞系的外显子测序检测EML4-ALK重排

原发性结肠腺癌的单倍型分析

作者用linked-read分析和单倍体块来探讨影响TP53中关键驱动变异的序列和结构变化，即C>T突变编码的一个候选危险非同义R213Q置换。结果显示TP53 C>T突变是反式等位基因单倍型。因此，肿瘤只包含一个单一的失活的TP53副本。以上结果确定了TP53的双等位基因失活。

图3 原发性结肠癌TP53TP53的驱动变异序列和结构分析

更多10x基因组案例：

[1] Greer S U, Nadauld L D, Lau B T, et al. Linked read sequencing resolves complex genomic rearrangements in gastric cancer metastases[J]. Genome Medicine, 2017, 9(1): 57. [linked read sequencing解决胃癌转移中复杂的基因组重排问题]

[2] Kawazu M, Kojima S, Ueno T, et al. Integrative analysis of genomic alterations in triple-negative breast cancer in association with homologous recombination deficiency[J]. PLoS Genetics, 2017, 13(6): e1006853. [10x Genomics应用于三阴性乳腺癌的基因组突变分析]

[3] Ryan L. Collins, Harrison Brand, Claire E. Redin, et al. Defining the diverse spectrum of inversions, complex structural variation, and chromothripsis in the morbid human genome[J]. Genome Biology, 2017, 18(1):36 [人类疾病基因组中结构变异的鉴定]