Applied Enviromental Microbiology. 2011, Apr 1.
Generation of Multimillion-Sequence 16S rRNA Gene Libraries from Complex Microbial Communities by Assembling Paired-End Illumina Reads. Andrea K. Bartram, Michael D. J. Lynch, Jennifer C. Stearns, Gabriel Moreno-Hagelsieb and Josh D. Neufeld.

研究背景

1. 针对实验室培养的混合细菌系2个重复样本和来自北极苔原土壤2个重复样本利用Illumina 2×125 两端测序平台进行V3可变性区域测序，采用自己研发的两端序列重叠组装方法分别得到高质量的>1 million 和>6 million序列，生物信息学分析显示两个重复样本间高度相似性和证实可以million数量级序列检测到样本中的低丰度细菌种类。
 

2.实验结果也提示可以利用多个标记和扩增16S rDNA不同可变性区域的引物序列能够同时检测多个样本的微生物菌落。
   

研究方法

1. 2个实验室培养的6个混合细菌系重复样本和2个来自北极苔原土壤重复样本分别抽提DNA

2. 修改后的341F和518R引物扩增V3区域，加标记接头， Illumina测序
3. 两端序列重叠组装

4. 序列的物种分类单元注释、操作分类单元OTU聚类和Good Coverage估计

5. 利用Sanger测序数据验证

分析结果
 

1. 针对实验室培养的混合细菌系2个重复样本(C1、C2)和来自北极苔原土壤2个重复样本(AT1、AT2)序列重叠组装后的序列统计结果显示C1和C2共1,306,630条， AT1和AT2共6,470,294条。

2. 扩增V3区域测序列，两端序列重叠组装，然后利用OTU聚类和RDP注释得到在门注释水平上两个重复样本存在较高相似性， AT1和AT2相似性达到0.99， AT1和AT2分别与ATS(Sanger测序)达到0.95。

3. AT1和AT2样本的细菌种类交集大部分是高丰度细菌种类，T1和AT2样本特异的细菌种类大部分是低丰度细菌种类。

4. AT1和AT2两样本混合后的AT样本Good Coverage估计值曲线显示随着随机抽取的序列数增加，检测到的操作分类单元OTU数增加最后达到几乎饱和。

参考文献
 

[1] Roman Matyášek1†, Simon Renny-Byfield2,3†, Jaroslav Fulne?ek1,et al. Next generation sequencing analysis reveals a relationship between rDNA unit diversity and locus number in Nicotiana diploids.BMC Genomics. 2012, 13:722
[2] Nicholas A. Bokulich, David A. Mills. Improved Selection of Internal Transcribed Spacer-Specific Primers Enables Quantitative,Ultra-High-Throughput Profiling of Fungal Communities.Appl Environ Microbiol. 2013 Apr; 79(8):2519-26.
[3] J Gregory Caporaso,Christian L Lauber, William A Walters, Donna Berg-Lyons,James Huntley, Noah Fierer, Sarah M Owens, Jason Betley, Louise Fraser,Markus Bauer, Niall Gormley, Jack A Gilbert, Geoff Smith and Rob Knight. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. 2012,Jan 1.
[4] Patrick H Degnan and Howard Ochman. Illumina-based analysis of microbial community diversity.The ISME Journal. 2012, Jun 16.