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在植物研究领域，受样本取材的限制和植物“异质性”的不足，植物单细胞测序的文章发表有限。随着10X Genomics单细胞平台技术的逐渐成熟，2月份，Plant Physiology发表首篇植物单细胞高通量测序的文章，开创了单细胞测序在植物研究领域的应用。

本文对拟南芥根组织原生质体进行高通量单细胞转录组测序，证实在植物中利用高通量单细胞测序的可行性和有效性。

题目

英文: Single-Cell RNA Sequencing Resolves Molecular Relationships Among Individual Plant Cells

中文：单细胞RNA测序解析单个植物细胞之间的分子关系

杂志：Plant Physiology (IF: 5.949)

发表时间：2019年2月4日

研究单位：密歇根大学

技术平台

scRNA-seq: 10x Genomics Chromium^TM系统scRNA v2试剂盒

Sequencing: Illumina Hiseq 4000

主要结果

• 证实以原生质体作为单细胞测序研究材料的可行性；

• 10x scRNA-seq检测了代表来自根的所有组织的单细胞基因表达；

• 10x scRNA-seq能识别拟南芥根中的稀有细胞类型，如静止中心细胞；

• 对拟南芥根突变体的检测，确定发育突变体对个体细胞的影响；

• 提供了单细胞分辨率下拟南芥根的第一代基因表达图谱。

研究思路

主要研究内容

1.拟南芥幼苗根尖细胞单细胞转录组分析

使用10X Genomics平台对野生型拟南芥根尖的原生质体中获得的7522个细胞进行scRNA-seq(含3个生物学重复)(图1A)。每个细胞获得约75000条reads，检测到约24000个UMIs和5000个基因的表达，在细胞群体中共检测到超过22000个基因的转录本。利用t-SNE算法对3个重复的数据进行聚类，发现该方法具有高度重复性；使用Seurat工具包分析scRNA-seq数据产生9个主要的clusters（图1B、1C）。为了使组织/细胞类型分配到特定的clusters,利用86个已知的根组织细胞特异性maker基因在转录组中的表达情况划分单细胞类群,发现无论是主要的根组织类群，还是特定组织中的特异细胞类型都能在9个类群中被有效检测到：特定细胞(cluster 0、5)、根毛表皮细胞(cluster 4、8)、非毛表皮细胞(cluster 3)、皮层(cluster 6)、内胚层(cluster 7)、分生组织内皮(cluster 2)和根冠(cluster 1)(图1D-1G）。

图1.野生型拟南芥根的单细胞转录组测序流程及聚类分析

2. 表皮和静止中心细胞的分析

为了评估scRNA-seq分析细胞类型发育分化的可行性，选取表皮组织数据来定义拟南芥的根毛和非毛细胞分化。代表表皮组织和发育相关的根冠组织（图1C中的cluster 1、3、4和8）被重新聚类产生11个较小的cluster；通过分析这些cluster中差异表达基因和根表皮、根冠的43个marker基因的积累表达定义了表示根毛细胞（cluster 1、2、3）、非毛细胞（cluster 0、8、9）、小柱根冠细胞（cluster 10）、侧根冠细胞(cluster 4、5、6和分生组织细胞（cluster 7）（图2A、2B）。为了分析表皮细胞中的基因表达模式，在根毛细胞和非毛细胞中分别对maker基因表达谱分析，分别定义了代表两种细胞分化早、中、晚期分化的cluster(图2C、2D)。有趣的是，cluster 7连接了根毛和非毛细胞的早期分化的cluster，表明cluster 7内的两种表皮细胞类型具有共同的发育起源。随后采用Monocle2和Destiny两种分析方法都证实cluster 7中包含的分生组织细胞可以向两个方向分化为根毛细胞和非毛细胞（图2E-2H）。

图2.根表皮和根冠组织单细胞转录组分析（原文图4）

为了进一步探索表皮细胞的起源，评估了cluster 7细胞中早期根毛和非毛细胞调节因子的表达情况，发现cluster 7中的大部分细胞至少表达一个根毛marker基因和一个非毛发marker基因，表明这些细胞可能是表皮细胞谱系的起源（表皮干细胞或表皮干细胞子细胞）(图3A)。接下来探索QC细胞(静止中心细胞，位于拟南芥根分生组织中的根表皮干细胞)可能存在于cluster 7中的可能性。使用已知QC表达的marker基因，发现cluster 7下部的相对较小的一组细胞始终表达marker基因（图3B），并鉴定了2个表达marker基因最显著的细胞（图3C），数据结果表明scRNA-seq能够鉴定代表稀有QC细胞的细胞群。

图3.静止中心细胞的鉴定（原文图5）

3. rhd6和gl2根表皮突变体的单细胞分析

接下来探索scRNA-seq在单细胞分辨率下分析突变体表型的可行性。对rhd6（缺乏根毛细胞）和gl2（缺乏非毛细胞）两种突变体的根组织进行scRNA-seq，并和野生型的数据一起进行聚类分析产生12个cluster(图4A、4B)；还发现rhd6突变体根毛细胞与野生型相比其比例显著减少， gl2突变体非毛细胞的比例也显著减少；另外大部分maker基因的表达也消失不见（图4C）。使用单细胞转录组来分析rhd6和gl2突变体中异常表皮细胞的特征，发现rhd6和gl2突变体表皮细胞中仍然分别有根毛和非毛细胞maker基因的表达，表明这些突变体并没有完全阻断相应细胞的分化（图4D）。这证明了scRNA-seq数据用于定义细胞亚群并在单细胞分辨率下表征突变表型的有用性。

图4.野生型和根表皮突变体之间根单细胞转录组比较分析（原文图6）

结论

在本报告中，我们展示了10X Genomics Chromium System用于拟南芥根原生质体中获取高通量单细胞转录组数据分析的可行性和实用性， 本文获得了超过10000个单细胞转录组数据，代表了所有主要的根组织类型，包括相对稀有的细胞类型以及整个分化阶段的细胞。同时进一步展示了来自野生型和突变体根的单细胞转录组的比较分析，以确定单细胞分辨率下的基因功能。此方法可用于获得和分析来自其他植物器官和植物物种的单细胞基因表达，前提是原生质体的分离并且具有合适的组织/细胞特异性marker基因。

总之，这些研究提供了拟南芥根中基因转录模式的详细视图，提供了单细胞分辨率下拟南芥根的第一代基因表达图谱。该数据集可用于定义跨越个体根细胞的任何感兴趣基因的转录物积累，从而提供对单细胞水平的基因表达和功能的有价值的了解。