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本文在单细胞水平上研究胚胎发生过程中染色质的调节动态。使用sci-ATAC-seq方法，分析果蝇胚胎的20000多个单核的染色质可接近性。结果表明，一个共同的发育程序可以联系到其他物种中的中内胚层谱系；确定了30075个具有组织特异性可接近性的远端调节元件，验证了预测的增强子亚群在转基因胚胎中的胚层特异性。总之，研究结果证明了——在单细胞水平上研究胚胎能够解决发育过程中染色质景观的动态变化，及揭示后生动物胚层和细胞类型的顺式调控程序。

研究思路

主要研究结果

1. 胚胎发育过程中染色质可接近性的异质性

使用sci-ATAC-seq来处理来自甲醛固定的果蝇胚胎的细胞核，将基因组划分为2kb的窗口，并根据每个窗口中是否观察到任何读数对每个细胞进行评分。单个细胞中可接近性的测量分布稀疏，但数据的结构足以揭示具有相似染色质可接近性的细胞亚群（图1a-c）。为了比对基础调控元素，汇总每个时间点最大4-5个clade中的细胞数据，以调用每个‘in silico-sorted’ clade的可接近性峰值（图1d）。结果揭示在胚胎发生过程中染色质可接近性的高度动态和异质性，与之前的时间点相比，在后期时间点识别出的差异可接近位点大约是其两倍。

为确定每个细胞clade的类型，将可接近区域与3841个发育增强子和9356个基因启动子比较，其中胚胎发生具有特异性的组织活性。6-8h和10-12h的四个主要分支对应三个主要的胚层，有两个分区：外胚层，分为神经源性（clade1）和非神经原性（clade2）谱系；中胚层，将其分成肌源性中胚层（clade3）和非肌源性中胚层（如脂肪体和血细胞）与内胚层（clade4）组合（扩展图1）。后者表明非肌源性中胚层和内胚层表现出相似的染色质可接近性，这表明共同的发育过程。

图1  果蝇胚胎发育过程中染色质可及性的单细胞分析

扩展图1 6-8h和10-12h LSI类的增强子富集

2.早期胚胎染色质可接近性的发育动态和空间异质性

应用t-SNE捕捉胚胎发育动态，细胞的密度峰聚类使得能够在2-4h识别18个细胞簇（图2a），这些簇为活性增强子和转录因子的相对富集分析显示在其发育阶段显著差异（图2b），发育轨迹将细胞分成三个主要分支，这与对主要胚层的注释一致（图2c）。

染色质可接近性反映了沿着胚胎前后（A-P）和背腹（D-V）轴的精制空间域中的增强子活性。两种基因的前增强子在假定的前胚盘簇（cluster6和15）的细胞中具有更大的可接近性，而后增强子在推定的后胚盘簇（cluster4、7和16）中表现更大的可接近性（图2e、2f）。表明sci-ATAC-seq可以鉴定细胞亚群中特异性可接近的调节区域，而不需要FACS分选；另外，这些早期的原肠胚前细胞命运事件是由染色质可接近性的空间异质性支持的。

图2 早期胚胎染色质可及性的时间动态和空间异质性

3. 染色质可接近性推断单个细胞类型

将t-SNE应用于后期时间点，在谱系定型（6-8h）和分化（10-12h）期间，显示不同的细胞簇，可以很容易地观察到特定组织或细胞类型（图3a、3b）。一些小的簇被识别为由组合索引产生的可能 “碰撞”，因此被丢弃（图3a、3b中的紫色簇）；对于所有剩余的聚类，细胞类型分配与胚层clade分配大致一致（图3c）。虽然低估了这些阶段存在的细胞数量，但数据显然不会偏向于任何特定的组织或细胞类型。

图3.基于染色质可接近性将单细胞分配到组织、细胞类型

4. 预测的增强子在转基因胚胎中的胚层特异性

为确定具有组织特异性染色质可接近性的元素是否与真正的组织特异性增强子相对应，测试了转基因胚胎中31种元件。选择在6-8h和/或10-12h显示clade特异性可接近性的启动子区域元件，其与先前表征的增强子不重叠。结果显示：94％测试区域在体内起到发育增强子的作用；90％活性增强子在预测组织中显示出活性，其中23个是该组织专有的（图4）。由于卵黄是胚胎外的，表明卵黄和中胚层组织间存在着潜在的调节联系，是由GATA转录因子在卵黄和非肌源性中胚层中的作用所支持的。

图4 使用sci-ATAC-seq预测组织特异性增强子活性

结论

本文证明了sci-ATAC-seq不仅能够阐明染色质可接近性的发展动态，而且能够大规模预测体内增强子活性。通过结合每个t-SNE簇内细胞的读数，生成了染色质可接近性的细胞类型特异性轨迹，揭示了细胞类型之间的大量差异。

一个扩展的数据集包括更多的每个时间点的细胞，涵盖果蝇发育的全部过程，它有潜力识别更罕见的细胞类型，并揭示染色质可接近性景观的完整连续视图。另外，染色质状态、转录输出、谱系历史和空间信息在单细胞分辨率下的整合有可能解开生物体基因组如何编码其发育。

参考文献

Cusanovich, Reddington, Garfield et al., The cis-regulatory dynamics of embryonic development at single cell resolution. Nature, published online 14 March 2018. DOI: 10.1038/nature25981.

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