巨噬细胞衍生的netrin-1通过激活血管平滑肌细胞中的MMP3促进腹主动脉瘤的形成
腹主动脉瘤的特征是广泛的细胞外基质碎裂和炎症，然而这些引发的局部血管损伤机制尚不明确。研究人员在前期工作中已经确认神经突起导向因子（netrin-1），一种具有独特层粘连蛋白样结构的神经元，是一种指导白细胞迁移的关键化学脉冲蛋白。
本文中，作者基于10x Genomcis ChromiumTM平台的3’ single cell转录组测序，对小鼠腹主动脉瘤组织进行单细胞测序，发现活化的巨噬细胞表达netrin-1。同时，通过一系列的小鼠嵌合体模型证明，netrin-1高表达能激活其受体neogenin-1，从而增强MMP3的催化活性。而MMP3的缺失则能保护小鼠免于发展为腹主动脉瘤。
此研究提供了重要的机制证据，证明巨噬细胞衍生的netrin-1如何影响局灶性MMP3激活，干扰这些串扰的干预可能是腹主动脉瘤背景下未来药物开发治疗策略的基石。
研究思路
主要研究内容
1. Netrin-1在小鼠和人主动脉瘤中高表达，这可能在主动脉瘤中起致病作用。
构建小鼠主动脉瘤模型，研究主动脉病变部位内netrin-1的水平。定量RT-PCR（图1a）与Western印迹（图1b）均证实，与健康组织相比，人腹主动脉瘤中的netrin-1(Ntn1)表达显著增加。这与小鼠组织（图1c）/人类组织（图1d）的主动脉切片免疫荧光染色结果一致。
图1.Netrin-1在人和小鼠AAA中高度表达
（a. 定量RT-PCR；b. Western印迹；c/d. 小鼠和人的主动脉切片免疫荧光染色）
2. 造血谱系中的Netrin-1缺乏保护小鼠免于发展为腹主动脉瘤
利用胚胎肝脏移植策略建立Ntn1−/−ApoE−/− (Ntn1−/−→ApoE−/−)和Ntn1+/+ApoE−/− (WT→ApoE−/−)小鼠嵌合体，并输注28天的AngⅡ或pBS。
WT→ApoE−/−小鼠有大部分具有主动脉瘤特征，而Ntn1−/−→ApoE−/−小鼠相对较少（图2b-d）。与健康小鼠相比，Ang II处理的WT→ApoE−/−小鼠血管扩张明显增加，Ang II处理的Ntn1−/−→ApoE−/−小鼠的主动脉直径减小（图2f）。表明在造血室中netrin-1的缺失可以防止腹主动脉发展。炎症和细胞外基质降解是腹主动脉瘤的关键标志，通过巨噬细胞浸润和弹性蛋白损伤评估，结果观察到netrin-1的表达可能导致弹性蛋白损伤并导致血管破裂（图2g-i）。这些发现表明造血衍生的netrin-1在主动脉壁破坏中发挥重要作用。
图2 造血谱系中的Netrin-1缺失防止AAA
（a. 促高血压效应评估；b. 动脉瘤患病率；c/d. 严重性分层；e. 彩色多普勒超声成像）
3. 主动脉巨噬细胞亚群中netrin-1的独特特征
为确定造血谱系中哪个细胞负责netrin-1的表达，研究人员通过scRNA-seq分析小鼠腹主动脉瘤的转录组特征，发现约83％表达Ntn1的细胞为巨噬细胞（图3c, d）。小鼠和人类的腹主动脉瘤切片的双重免疫荧光染色表明，与注入PBS的健康小鼠相比，CD68阳性巨噬细胞中，netrin-1蛋白显著存在（图3e）。Ntn1富集的巨噬细胞是高表达促炎性和促血管生成标记的巨噬细胞，而含有较低水平Ntn1的巨噬细胞表现出高抗炎性巨噬细胞（图3f）。表明巨噬细胞衍生的netrin-1在腹主动脉瘤中的致病作用。
图3 巨噬细胞中的Netrin-1缺失抑制AAA的发展
（a. 患病主动脉中不同的免疫亚群；b. Ntn1在不同cluster的分布特征；c/d. 不同细胞种类表达Ntn1比例；e. 小鼠/人腹主动脉瘤切片的双重免疫荧光染色；f. Ntn1水平与巨噬细胞种类；h-m. Ntn1flox/floxLysMcre+/− (Ntn1−/−Mø)和 Ntn1flox/floxLysMcre-/- Nnt1l−/− (WTMø)小鼠嵌合体模型）
4. 巨噬细胞中Netrin-1缺失抑制腹主动脉瘤的发展
研究人员又进一步建立Ntn1flox/floxLysMcre+/− (Ntn1−/−Mø)和 Ntn1flox/floxLysMcre-/- Nnt1l−/− (WTMø)小鼠嵌合体，并给小鼠注射单剂量的腺病毒（AAV）载体（图3h-m）。观察结果与用Ntn1−/−→ApoE−/−嵌合体一致，且表明巨噬细胞中缺乏netrin-1降低了发展为腹主动脉瘤的风险。
5. Netrin-1调节血管壁中MMP3的活性
Mmp3是一种关键的细胞外基质降解酶催化具有辅助炎症特性的底物，研究人员对输注Ang II的Ntn1−/−→ApoE−/−和WT→ApoE−/−小鼠分离的主动脉进行RNA测序发现mmp3基因在Ntn1−/−→ApoE−/−小鼠主动脉中表达显著下调（图4b）。在Ntn1−/−Mø小鼠的主动脉切片中结果相同（图4d）。这些均证明在腹主动脉瘤中，netrin-1能为MMP3的表达提供强有力的细胞外基质降解能力。
为了研究MMP3在腹主动脉瘤中的直接作用，研究人员在PCSK9AAV注射前攻击Mmp3-/-小鼠，结果与WT小鼠相比，MMP3缺失显著降低腹主动脉瘤和主动脉扩张的发生率（图4h-4g）。在具有活性MMP3的WT小鼠血管壁中明显存在广泛的弹性蛋白降解，而MMP3缺失小鼠中具有完整的弹性蛋白纤维（图4i）。
图4 Netrin-1调节AAA中的MMP3活性
（Ntn1−/−→ApoE−/−和WT→ApoE−/−小鼠模型：a. 基因表达热图；b. Mmp3转录物表达的RNA-seq和RT-PCR验证结果；c. 免疫荧光检测MMP3蛋白表达。Ntn1−/−Mø小鼠模型：d. 免疫荧光检测MMP3蛋白表达）
6. 巨噬细胞缺失的MMP3无法提供抗腹主动脉瘤的作用
巨噬细胞是动脉粥样硬化病变中MMP3的重要来源， MMP3与患病主动脉中募集的CD68阳性巨噬细胞共定位（图5a），重组netrin-1剂量依赖性地增加骨髓衍生巨噬细胞中MMP3酶活性（图5b）。用WT或Mmp3-/-骨髓细胞建立WT→WT和Mmp3-/-→WT骨髓嵌合体来评估巨噬细胞衍生的MMP3在体内的作用，未观察到两组间发生率、腹主动脉瘤严重性及血管扩大的差异（图5c, d）。表明netrin-1可在体外诱导巨噬细胞中MMP3的活性，但骨髓谱系中MMP3的缺失不足以在体内提供抗腹主动脉瘤的作用。
7. 血管平滑肌细胞衍生的MMP3加重腹主动脉瘤
Mmp3-/-小鼠具有抗AAA作用，而骨髓细胞中具有特异性MMP3缺失的小鼠发展为腹主动脉瘤，推测通过动脉壁内的驻留血管细胞的MMP3表达可能有助于AAA的发展。将小鼠原代VSMC于重组netrin-1以剂量依赖性方式显著诱导MMP3的酶活性（图5e），表明巨噬细胞衍生的netrin-1可以诱导VSMCs中的MMP3活性（图5f）。
利用从WT小鼠分离的骨髓细胞建立WT→Mmp3-/-或WT→WT嵌合体，研究VSMCs衍生的MMP3是否可能有助于腹主动脉瘤的发病机制。结果显示间质区室中MMP3的缺失保留了健康的弹性蛋白纤维，巨噬细胞来源的netrin-1驱动VSMCs中MMP3催化活性（图5g-5k）。
图5 MMP3有助于腹主动脉瘤发展
8. Netrin-1调节钙内流，激活血管平滑肌细胞中的MMP3
进一步研究调节netrin-1依赖性对VSMCs中MMP3的影响的分子机制。发现netrin-1有效且快速地诱导VSMC中的细胞内Ca2+波（图6a）；在Ca2 +螯合剂存在下用netrin-1刺激VSMC减弱了MMP3活性的诱导（图6b）；在BAPTA存在下逆转染色模式表明netrin-1诱导的NFATc3核转位依赖于Ca2+（图6c）；在NFATc3抑制剂VIVIT肽存在下，netrin-1诱导的MMP3催化活性完全被消除（图6d）。这些发现表明netrin-1通过同步VSMC中的Ca2+信号传导来驱动MMP3活性的核心作用。
9. Netrin-1通过其在VSMC中的受体neogenin-1调节MMP3
研究netrin-1是否可以通过neogenin-1受体调节MMP3的表达,结果表明netrin-1选择性激活neogenin-1触发激活MMP3所需的信号级联反应（图6e-6g）。为了证明巨噬细胞衍生的netrin-1可以通过VSMC中的neogenin-1调节MMP3，在transwell中对巨噬细胞和VSMC进行了共培养测定。与活化的巨噬细胞共培养的VSMC中MMP3活性增加，而抗neogenin-1阻断抗体的VSMC中MMP3活性显着降低（图6j）。结果进一步确定巨噬细胞衍生的netrin-1通过VSMC中的neogenin-1活化来调节的MMP3活性。
图6 Netrin-1通过其受体neogenin-1动员Ca2+并驱动血管平滑肌细胞中的MMP3活性
参考文献：
Tarik Hadi, Ludovic Boytard, Michele Silvestro，et al. 1Macrophage-derived netrin-1 promotes abdominal aortic aneurysm formation by activating MMP3 in vascular smooth muscle cells.201812.Nature communications(12.353)
