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肝癌循环肿瘤细胞的高密度单细胞转录组分析

研究背景

肝细胞癌（HCC）患者将肿瘤细胞释放到血液中，可用细胞表面标志物进行检测。 现许多报道表明，循环肿瘤细胞（CTC）数量与不良临床结果之间存在直接关联，但很少有研究提供CTC分子全面表征。 由于在HCC晚期患者中获取组织样本的机会有限，因此开发新技术对常规临床条件下鉴定HCC癌症驱动因素至关重要。

本文研究人员采用顺序结合图像流式细胞仪和高密度单细胞mRNA测序，以识别HCC患者的CTC。 使用该方法进行基因组表达分析证明CTC异质性，并且有助于检测HCC中已知的致癌驱动因子，例如IGF2。这种整合分析方法为使用液体活检在HCC中生物标志物的开发提供了新方向。

研究思路

为实现CTC转录组的全面表征，开发了一种结合成像流式细胞仪（IFC）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）的分析管道。使用8 mL全血，包括3个连续步骤：（1）CD45阴性富集；（2）使用IFC选择患者；（3）使用10x scRNA-seq（图1）。

图1. 研究思路

主要研究内容

1. 10x scRNA-seq鉴定CTC

分别对患者1和2中的7104和3130个细胞进行了10x scRNA-seq,使用变量最大的基因来计算数据集中变异性的主要来源，如主成分（PC）分析所示。该方法鉴定了来自患者1的两个CTC和来自患者2的一个CTC，其基因表达谱与血液中的其他克隆群体显著不同。接下来基于其基因表达谱来表征其余的血细胞，鉴定了与单核细胞、NK细胞、B细胞、T细胞、浆细胞样树突细胞和红细胞相容的细胞（图2C、2D）。

图2.10x scRNA-seq鉴定CTC

2.潜在HCC驱动基因的鉴定

比较来自2名患者的3个候选CTC与其余细胞的比例表达值时，在100个顶部差异表达基因中发现了许多肝脏相关基因（图3A）。这些基因参与肝脏生理学，包括载脂蛋白、凝血因子、乙醇脱氢酶、细胞色素等。为进一步支持这些异常细胞的肝谱系，与所有其他细胞相比对其缩放表达进行了基因集富集分析（GSEA），胆汁酸和异生素代谢在这些细胞中最顶层富集（图3B）。

10x scRNA-seq对于使用全转录组数据准确区分CTC至关重要。当检查ASGPR1（一种用于检测HCC15中CTC的标记物）的表达时，发现它在很大比例的非CTC中表达，主要是单核细胞（图3C）。总之，这些观察结果进一步证明了用于CTC检测的单一（或靶向）标记物方法的局限性，10x scRNA-seq在HCC患者的血液中检测到具有高度暗示肝谱系的细胞。

3. 10x scRNA-seq鉴定HCC驱动基因并揭示CTC中的分子异质性

在两个患者中，候选CTC表达肝细胞癌的上调非编码RNA（HULC），而在其他血细胞中不存在， HULC是一种在HCC17中具有已知致癌特性的lncRNA；还检测到在HCC中频繁上调的其他基因，如SPINK1、IGF2、SPP1或BRIC5，表明肝脏谱系的循环细胞既未在健康供体的血液中检测到，也未在非恶性慢性肝病患者中检测到，支持了候选CTC的恶性特征。在CTC中差异表达的基因中，检测到IGF2的过表达（图3A），该基因在20％的早期HCC中过表达并且表征为HCC附睾。仅通过探测肿瘤的突变情况不能评估IGF2的调节，这使得CTC的10x scRNA-seq成为检测非突变的可药用基因组突变（如IGF2过表达）的工具。

除了IGF2之外，许多基因在患者1中检测到的两个候选CTC之间差异表达，此外，GSEA揭示了在该患者的2个候选CTC中富集的排名最高的基因集的差异，包括提示CTC＃1中更具侵略性的生物学行为的特征（图3B，如E2F靶标、G2M检查点、KRAS信号传导）。这些数据表明CTC区室中的转录组异质性，使用scRNAseq表达谱可以帮助追踪CTC中的癌症异质性。

图3. CTC的表征和潜在HCC驱动基因的鉴定

结论

本文使用10x scRNA-seq来鉴定和表征HCC患者的CTC，其原理验证研究证明了转录组分析的优势，可以很好地检测CTC，检测HCC异质性的潜在作用及检测HCC驱动基因的能力，这将有助于制定患者的治疗干预方案。

参考文献

Delia D’Avola,Carlos Villacorta-Martin, Sebastiao N. Martins-Filho,et al.High-density single cell mRNA sequencing to characterize circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. Scientific Reports.2018,08.