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2018年初，张鹍教授团队在Nature Biotechnology上发表了一个基于全新单细胞核测序方法的成年人脑第二代单细胞图谱。

该研究通过结合基于微流体的单核测序（snDrop-seq）和单细胞转座体超敏性位点测序（scTHS-seq）的方法，不仅能利用转录组学分析鉴定不同功能的细胞类型，还能通过表观遗传学特征更好描述这些表达图谱是如何调节或者维持的。

研究思路

主要研究结果

1、人体大脑皮层和小脑中的单细胞组成

研究人员采取六个不同成人死后脑部样本（包含视觉皮层（Brodmann区域17（BA17）或视觉区域1（V1），额叶皮层（BA10和BA6）以及外侧小脑半球），分别利用snDrop-seq和scTHS-seq技术对人脑的细胞组成及转录调控进行研究（图1a）。

通过snDrop-seq，研究人员对过滤后剩下的36,166个细胞进行异质性分析，将其分成35个不同的cluster（图1b）。并分析了这些细胞的区域差异，包括小脑特异性Ast（Ast_Cer）和OPCs，以及在视觉和额叶皮质之间检测到的不同Ex神经元群体（图1c）。

为了确定相应的调节特征，研究人员对32,869个单核scTHS-seq数据，进行聚类，利用15,786个数据集进一步获得相应细胞图谱（图1d），并将其定位到相应的区域（图1e）。

图1.单细胞整合分析解决了成年人脑中区域内和区域间细胞多样性

2、通过snDrop-seq数据分析细胞类型和区域异质性

研究人员通过转录组数据，利用marker genes对不同细胞类群或亚群进行定义，发现snDrop-seq能更精细的对细胞亚群进行分类，表明该技术的高敏感性（图2a，2b）。利用相关marker genes进行RNA原位杂交，发现视觉皮层细胞亚群存在区域异质性（图2c），并进一步证明EYA4 + Ex3d神经元对于视觉皮层的第4层是特异性的（图2d）。

研究人员对小脑进行相关研究时，发现相较于大脑，其细胞结构更加明显（图2e），利用相关marker genes和蛋白染色将其主要分为Gran和Purk神经元及其支持细胞三大类群（图2f，2g）。还发现两个不同的Purk神经元群体表达抑制marker gene GAD1 / GAD2（图2f），并且可以通过SORCS3表达情况进行区分（图2h）。

图2.在分子和空间上对不同的细胞类型和亚型进行鉴定和分类

3、转录组和染色质可接近性综合分析模型

鉴于转录数据的高分辨率，研究人员整合转录组数据和染色质可接近性数据，获得一个更为精细的分类模型（GBM，梯度增强模型），该模型是基于差异表达模式预测差异可及的基因组位点（图3a）。通过这种方式，研究人员不仅区分了神经细胞和非神经细胞类型，还将Ex与In细胞以及后续的亚型进行了区分（图3b，3c）。

此外，由于这种整合分析方式是基于高分辨的差异表达基因基础上的，所以使相关的差异可接近性位点分辨率更高，以进一步划分染色质（图3d-f）。研究人员对相关细胞类型和亚型的marker genes启动子上的可接近性进行了分析，发现富集程度很高，也证实了分类的可靠性（图3g）。因此，尽管与转录数据相比，可接近性数据的固有细胞类型分辨率较低，但scTHS-seq和snDrop-seq整合数据可获得更加详尽的表观遗传图谱。

图3.转录和表观遗传亚型的整合图谱

4、髓鞘再生中的转录因子活性

继表观遗传学分群后，研究人员试图鉴定与每种细胞类型的调节状态相关的转录因子（TF）。他们寻找了在鉴定的细胞类型的差异染色质可接近性结合位点上高表达的TF（图4a），鉴定出与视觉皮层中至少一种主要细胞类型显示出统计学显着相关性的TF（图4b）。除此之外，他们还发现了区分OPC和Oli种群的特异性TF特征（图4b），并对视觉皮层中这些谱系的分化状态和相关的基因表达特征进行了评估。他们基于Destiny的扩散映射，绘制了由OPCs到Oli发育轨迹，发现中间细胞（未成熟的Oli（iOli））具有独立于实验批次的独特表达特征（图4c，4d），可对人类早期机制进行深入了解。

为定义这些基因表达动力学的调节机制，研究人员从scTHS-seq数据评估了视觉皮层中OPC和Oli亚群中差异上调基因的可接近性，发现OPC，iOli和mOli基因组的调控位点显示出差异可接近性，与表达数据一致（图4e）。小鼠OPC存活和迁移所必需的，而OPC可访问站点内最重要的TF活动与SOX9相关（图4f）。

此外，他们还发现iOli特异性可及位点显示TCF4 TF结合的显着富集（图4f），其在调节Wnt /β-连环蛋白以促进小鼠中的髓鞘再生中具有重要作用。因此，TF分析暗示机体内具有保守的调节机制，维持成体少突胶质祖细胞并协调成熟以维持髓鞘再生。

图4.将转录因子（TF）活性映射到特定细胞类型以解析髓鞘再生程序

5、致病风险映射于特定脑部细胞类群

针对10种脑相关疾病的全基因组关联研究（GWAS），研究人员在以SNP为中心的100kb中寻找富集的可接近性位点，随机排列评估显着性（图5a）。该分析发现某些可接近性位点确实在病人的某些细胞群或亚群中存在高富集（图5b-d）。值得注意的是，他们发现Mic中阿尔茨海默病（AD）风险变异的程度高（Z-score= 5.41），这与被发现于晚发性AD皮质中被激活的Mic特征一致。

研究人员将scHTS-seq与bulk ATAC-seq数据的进行了比较发现scHTS-seq对预测Mic调节位点及其相关疾病特异性风险变异富集的具有高敏感性（图5e-g）。

结论

本文利用snDrop-seq和scHTS-seq对成人脑细胞进行单细胞转录组和染色质可接近性分析及整合分析，发现整合分析能更精细的对细胞进行分类，并且证明基于转录组信息的表观遗传谱更详尽。

参考文献

Lake B B, Chen S, Sos B C, et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain[J]. Nature Biotechnology, 2017, 36(1).