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本文以“Profiling human breast epithelial cells using single cell RNA sequencing identifies cell diversity”为题2018年5月发表在杂志《nature communications》，旨在深入了解人乳腺上皮细胞图谱，并为乳腺癌发生期间系统如何出错奠定基础。

单细胞转录组测序揭示人乳腺上皮细胞多样性

研究背景

乳腺癌是由于乳腺上皮细胞的遗传信息改变导致组织内稳态失衡而引起的。虽已报道过几种明显不同的上皮细胞亚群，但对人乳腺细胞异质性和分化等级的理解还不全面。

本文研究者利用单细胞技术（scRNAseq）研究25790个原发性人乳腺上皮细胞（来自于乳房缩小整形术的健康个体）表达谱。聚类分析结果显示：存在3个明显的上皮细胞亚群，1个基底细胞类型和2个腔细胞类型（分泌L1型和激素响应L2型）。拟时分化轨迹显示一条连续的轨迹曲线，将基底细胞与2个分化的腔细胞分支紧密相连。

研究结果

1、Fluidigm C1 microfluidics-enabled scRNAseq揭示乳腺上皮细胞中存在3种细胞类型

作者收集一群健康女性的乳腺上皮细胞，利用C1单细胞全自动制备系统制备基底细胞和腔细胞的单细胞文库，进行单细胞测序( 图a)。共捕获来自3个个体的868个细胞， 对这些细胞进行tSNE分析，可分成3个明显不同的细胞类别( 图b)，然后找到每一类中显著上调的基因( 图c)。

与之前报道的数据相比，发现L1紧密对应腔祖细胞，L2紧密对应成熟腔细胞，基底细胞与基底/乳腺干细胞 (MaSCs)相匹配。对基底细胞群作进一步分析，结果发现该细胞群中间叶细胞和干细胞的marker基因 ZEB1和 TCF4 表达增加( 图d)。先前研究发现marker基因的表达与乳腺干细胞有直接联系，所以ZEB1/TCF4高表达可能说明基底细胞具有发展成乳腺干细胞的潜能。

2、10x Genomics Chromium droplet-mediated scRNAseq揭示细胞亚群多样性

作者利用流式细胞术对4个未生育女性个体(Ind4-7)分离基底细胞和腔细胞 (EpCAM+/CD49fhi/lo)，然后进行10X单细胞测序 ( 图a)，共得到24646个细胞，平均测序深度 60000 reads/cell。对Ind4进行聚类分析，确实存在3个主要的上皮细胞类型--Basal (KRT14+)，Luminal1(L1; KRT18+/SLPI+)，Luminal2(L2; KRT18+/ANKRD30A+) (图b)。

另外，还有3个额外的小细胞群，基质细胞的marker -VIM 在cluster8中高表达，cluster 9 中特异表达内皮细胞的marker-ESAM，而cluster10包含少量离散细胞，可能是一些异常值。作者推测clusters(8–10)不是上皮细胞，下一步分析时会将它们作为unclassified (X) 。作者还对Ind5–7个体进行了聚类分析，结果与Ind4类似，在每个主要的上皮细胞类群中分别又包含多个亚群( 图c）。

为了确定细胞状态，作者利用基因打分的分析方法比较Ind4与Ind5–7，发现在所有个体间主要的细胞类型 (Basal, L1, L2)是能相互匹配的。另外，L1有两种不同的细胞状态-L1.1和L1.2，L2细胞群同质性更高，因此认为是一个单独的群体。基底细胞（Basal）也有两种状态--Basal（B）和Myoepithelial（Myo）( 图a–c)。对4个个体的24465个细胞进行重新聚类分析，可分为Basal (B), Myoepithelial(Myo),Luminal1.1(L1.1),Luminal1.2(L1.2), Luminal2 (L2), the small Unclassified(X)( 图d,e)。

3、细胞类型和状态的空间定位

作者通过免疫荧光分析方法验证scRNAseq结果，免疫染色发现ZEB1蛋白在基底上皮细胞中表达 ( 图a)，之前报道显示ZEB1表达的基底细胞具有乳腺干细胞活性(图b)。另外，TCF4蛋白也在基底细胞中表达 ( 图c)。KRT14是基底细胞的标志，但它在Myoepithelial细胞状态中高表达 ( 图d)，免疫荧光分析显示KRT14高表达的细胞主要分布在导管区的基底细胞层，而在小叶基底细胞中表达较低 (图e)。

作者使用marker基因--SLPI（L1）和ANKRD30A（L2）鉴定细胞在乳腺组织中的分布，发现L1和L2细胞在导管和小叶中都是相邻的( 图a)。 ANKRD30A与 ER (32.4% of cells), PR (38.0%), AR(46.8%)重叠，SLPI与ER,PR,AR重叠比例较低 ( 图b–d)。在成人上皮组织内增殖与祖细胞活性有关，有趣的是在Basal, L1, L2中均看到了增殖细胞(图e–f)。基于细胞的基因表达信息，推测L1可能具有分泌功能，L2可能是乳腺上皮的激素响应单位。

4、构建乳腺上皮细胞拟时分化轨迹曲线

为了解这些细胞之间的相互联系，作者对来自Ind4–7个体的4000个细胞构建分化轨迹曲线，结果发现可将细胞分成3个分支--Basal, L1, L2 （图a)。大量证据显示乳腺干细胞存在于基底细胞内，因此作者手动设置基底细胞内的拟时分化起点( 图b)。L1.2位于L1和L2的中间，说明它代表一种腔祖细胞类型。在L1分支上，L1.2在L1.1的前面，说明L1.2是L1.1的祖先。

5、细胞亚群与癌细胞亚型相对应

为了将新分类的细胞亚群与乳腺癌亚型关联起来，作者采用基因打分方法直接将两者的marker基因进行对应，发现乳腺癌的腔细胞A和腔细胞B亚型与L2型腔细胞紧密相连。另外，Myo与三阴性乳腺癌（TNBC）的间叶细胞样亚型高度相似，TNBC的Basal1细胞与L1.1相似。总之，分析结果将乳腺癌亚型与上皮细胞的不同细胞群联系起来，显示乳腺癌的不同亚型可能来自于不同的肿瘤细胞。

结论

作者利用单细胞技术研究7个人类的乳腺上皮细胞，构建细胞分化轨迹曲线，发现基底细胞和腔细胞亚群可能会发展成不同的乳腺细胞亚型。

参考文献

Nguyen QH, Pervolarakis N, Blake K,et al.Profiling human breast epithelial cells using single cell RNA sequencingidentifies cell diversity. Nat Commun. 2018 May 23;9(1):2028. doi: 10.1038/s41467-018-04334-1.