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1.  Lin^-CD117 ⁺ Ly6A / E^-的单细胞分析识别不同NeP群体

研究者采用质量细胞计数法分析小鼠BM，目的是鉴定所有NeP。通过viSNE自动无偏分析发现，在Lin^-CD117⁺Ly6A/E^-中发现5个不同细胞簇细胞，在图1A中标记为簇#A- #E。Siglec F(簇#A)标记嗜酸性粒细胞、CD115(簇#B)标记单核细胞、Ly6G(簇#C)标记中性粒细胞、FcεRIa(簇#D)标记肥大细胞和嗜碱性粒细胞、CD16 / 32和CD34(簇#E)标志着CMP和GMP。中性粒细胞特异性抗原Ly6G在簇#C中从阴性到高表达的连续体，表明在该簇内存在NeP和前体(图1B)。

图1. Lin^-CD117 ⁺ Ly6A / E的^-单细胞分析识别骨髓细胞群体

2. 聚类#C的ScRNA-Seq分析揭示两个主要亚群（＃C1和＃C2）

为深入研究簇#C，对scRNA-seq的簇#C细胞进行了分类。在簇#C中发现两个主要亚群，＃C1在mRNA水平显示低Ly6g表达(图2A)，证实通过质量细胞计数发现该簇中低Ly6G蛋白表达。在表面标志物表达基础上，预测＃C1和＃C2为NeP候选物。对＃C1和＃C2进行大量RNA-seq转录组分析，并用#E和#B细胞作为对照组，发现＃C1表达高水平的GMP基因，包括Egr1、Fosb、Jun、Gata2和Gata1；对中性粒细胞发育至关重要的基因，包括Gfi1、Cebpa、Cebpe、Per3和Ets1。

图2. 聚类#C的ScRNA-Seq分析

3. Cluster＃C1细胞致力于早期阶段在体内生成单能NeP

采用过继转移方法分析＃C1在体内产生嗜中性粒细胞的功能，实验方案如图3A。供体细胞(CD45.2+)在第5天出现于血液中并第14天达到峰值(图3A)；进行单核细胞(Mo，CD115+)、嗜中性粒细胞(Ne，Ly6G+)、嗜酸性粒细胞(Eo，Siglec F+)或嗜碱性粒细胞(Ba，FcεRIa+)的表达分析。这些祖细胞NeP构成＃C1受体中几乎100％CD45.2+供体细胞衍生的白细胞；在对照组中，＃B(CD115+)仅产生单核细胞但不产生嗜中性粒细胞，＃A＃D＃E产生嗜中性粒细胞和单核细胞(图3B)。这些结果说明＃C1和＃C2祖细胞仅产生嗜中性粒细胞的能力受限。为了进一步确定＃C1细胞产生＃C2细胞，仅对CD45.2 BM的＃C1细胞(使用图2B中的策略)进行FACS分选，并将CD45.2+＃C1细胞过继转移到CD45.1。通过受体外周和BM在过继转移后产生＃C2来追踪CD45.2 +＃C1供体细胞的命运，再次证实＃C1是早期阶段NeP。

图3. Cluster＃C1细胞致力于早期阶段在体内生成单能NeP

4. Cluster＃C1细胞在BM和外周肿瘤中增加，并促进体内肿瘤生长

为了解＃C1 NeP在体内肿瘤中发生作用，使用黑素瘤小鼠模型观察BM的＃C1或＃C2细胞是否增加。结果检测到健康小鼠的簇#C细胞数量最少，而#C细胞在荷瘤小鼠周围增加10倍，表明鉴于肿瘤微环境，这些NeP从BM到外周的产生和排出增加。为测试NeP是否可以直接促进肿瘤生长，从CD45.2野生型供体小鼠中分选＃C1 NeP细胞、＃C2细胞、＃B细胞和#E细胞，并过继转移到受照射的CD45.1受体健康小鼠中。

如图4B所示，与两个时间点的#B细胞或#E细胞(CMP)相比，接受＃C1细胞或＃C2细胞的小鼠显示肿瘤生长增加；与＃C2细胞相比，＃C1 NeP在较晚的时间点促进肿瘤生长且更多＃C1 NeP衍生细胞浸润肿瘤，并且超过30％的＃C1 NeP衍生细胞表达PDL1，PDL1是有助于免疫抑制的抑制性共刺激分子(图4C)。因此，＃C1 NeP祖细胞对黑素瘤肿瘤生长有反应，并通过产生免疫抑制后代而具促进肿瘤生长的功能。

图4. Cluster＃C1细胞在BM和外周肿瘤中增加，并促进体内肿瘤生长

5. 两个hNeP子集仅在NSG-SGM3小鼠中产生中性粒细胞

将每个子集过继转移到NSG-SGM3(NSG-M3)小鼠中来检测体内CD34+和CD34- hNeP亚群的中性粒细胞效力。实验方案见图5A，使用流式细胞仪分析对照组血液中的单核细胞(Mo)、中性粒细胞(Ne)、嗜酸性粒细胞(Eo)和淋巴细胞(Ly)，包括T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞；将流式细胞仪组用于分析hNeP受体血液，过继转移后，在CD34 + hNeP和CD34- hNeP中检测到CD66b +细胞，但没有表达其他细胞类型，说明两个hNeP亚群都是仅产生中性粒细胞的单能祖细胞；在过继转移(第5天)后持续hNeP祖细胞子集重建嗜中性粒细胞库并持续到第28天，表明两个祖细胞亚群相对长期的中性粒细胞单向性(图5B)。

图5. hNeP仅在NSG-SGM3小鼠体内产生中性粒细胞

6. hNeP增加黑色素瘤患者血液，并促进NSG-M3小鼠早期骨肉瘤肿瘤生长

黑素瘤患者血液与健康患者血液的流式细胞术显示健康供体血液存在CD66b+CD117+细胞，CD34 + hNeP在健康血液中几乎检测不到，但在黑素瘤患者血液中升高(图6A)，黑素瘤患者血液中hNeP细胞增加与在小鼠黑素瘤模型中观察到的NeP一致，表明hNeP可以作为早期癌症检测的生物标志物候选物。检查hNeP在调节多种实体瘤类型生长中的作用，以观察NePs的肿瘤促进作用是否与NSG-M3小鼠肿瘤类型相关；如图6B，小鼠接受CD34 + hNeP或CD34-hNeP与对照的受体小鼠相比，hNeP细胞的肿瘤生长增加，表明hNeP也是肿瘤前和介导实体肿瘤生长的细胞。

图6. hNeP增加黑色素瘤患者血液并促进NSG-M3小鼠早期骨肉瘤肿瘤生长

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参考文献：

Yanfang Peipei Zhu, Lindsey Padgett,Huy Q. DinhIdentification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports.2018,8(24): 2329–2341.