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先来说一下单细胞测序的应用价值！以往我们可通过形态学外观、组织环境和标记基因表达来鉴定癌细胞，但现在利用精进的单细胞转录组测序技术，可以依据单个细胞的mRNA表达特征精确鉴定癌细胞和正常细胞以及二者之间的潜在关系，还可以揭示肿瘤的起源和支持恶性转化的转录轨迹。接下来以文献实例来具体说明，前方高能预警，文章略长，高分文章，你懂得~

10x单细胞转录组测序再次高调助力科学研究！2018年8月10日，来自英国桑格研究院和剑桥大学等的研究人员在著名期刊Science上发表了一篇名为“Single-cell transcriptomes from human kidneys reveal the cellular identity of renal tumors”的10x单细胞转录组文章。该文从肾癌、健康胎儿、正常人肾脏三个方面，通过大规模的单细胞转录组测序构建了人不同肾脏的细胞图谱（这对10x单细胞转录组测序来说是最easy的一步），研究者进一步锁定了与儿童肾母细胞瘤（Wilms）相关的特定胎儿细胞类型，突破性的发现了与肾癌（RCC）相关的正常细胞，并描绘了复杂的血管内皮生长因子（VEGF）信号通路。

研究路线

主要内容解读

1. 区分免疫和非免疫细胞

首先将72,501个胎儿、正常和肿瘤细胞分成免疫和非免疫细胞，进一步将转录组分类成不同的细胞簇。生成正常成熟细胞和胎儿细胞的细胞图谱，通过本研究的单细胞转录组数据分析得到的marker gene和参考文献中的marker gene来为每个细胞簇定义注释。

2. 正常人肾脏的细胞图谱

所有正常人肾脏非免疫细胞（37,951个）代表来自肾单位的不同微解剖区域，其中约80%是模糊类型的近端肾小管细胞，此外还有成纤维细胞、肌成纤维细胞和血管内皮细胞（肾小球内皮细胞和上行和下行直血管。

 图1正常人肾脏中的典型细胞类型

图S4所有正常人肾脏非免疫细胞图谱

3. 健康胎儿肾脏细胞图谱

胎儿肾脏细胞（4,858个）分为发育中的肾单位细胞[输尿管芽（UB），帽间质（CM）和原始囊泡（PV）细胞]和成纤维细胞、肌成纤维细胞、血管内皮细胞和神经节细胞。

   图2健康胎儿肾细胞图谱

图S5健康胎儿肾细胞图谱

为了确定位于肾发育的转录程序，鉴定了UB细胞 vs CM细胞和PV细胞差异表达的转录因子。应用拟时轨迹分析鉴定从CM到PV转换的转录因子，确定了与肾单位发育相关的已知和未知的转录因子，这一结果可以作为后续恶性肿瘤分析的参考。

图2拟时分析肾发育

4. 肾癌非免疫和免疫细胞图谱

对来自Wilms肿瘤（n = 3），ccRCC（n = 3）和pRCC（n = 1）的6,333个肿瘤非免疫细胞（图S7）和17,821肿瘤免疫细胞（图S8）构建细胞图谱。

图S7肾癌非免疫细胞图谱

 图S8肾癌免疫细胞图谱

5. Wilms肿瘤与正常胎儿肾脏细胞的相似性

使用逻辑回归来量化肿瘤和正常细胞簇之间的相似性，并结合全基因组测序获得的体细胞拷贝数变化（图S9）对单个癌细胞进行基因分型（图S10）。综合基因分型和相似性分析，发现：

• 来自肿瘤的肌成纤维细胞与来自胎儿与成熟肾脏的肌成纤维细胞相似（图3A）。

• Wilms细胞与正常胎儿细胞相似，不同的Wilms肿瘤细胞群与UB和PV细胞相似（图3A）。

图S9从bulk DNA样本中检测的肿瘤拷贝数

图S10使用单细胞RNA-seq数据对单个细胞进行基因分型

 图S11-S12每个非免疫＆免疫肿瘤细胞的CN基因分型 

图3 Wilms肿瘤与正常胎儿细胞相似性分析

为了验证Wilms细胞的UB和PV细胞特性，作者检测了肾癌和正常肾脏bulk样本中UB和PV细胞特异标记基因的表达情况。证实了PV和UB细胞在肾母细胞瘤中的存在。

另外，作者在一个肾源性静息样本（被认为代表Wilms肿瘤的前驱病变）中观察到，肾源性静息细胞也与UB或PV细胞相似。这一发现表明，产生胎儿肾单位不同细胞状态的潜力可以早期获得，或者不会因发展中的肾母细胞癌而丢失。

6. Wilms肿瘤细胞发育的探究

对Wilms肿瘤细胞拟时分析，发现了源自UB的两个转录程序：一是发展为肾源性静息细胞，另一是发展为Wilms癌细胞（图3C）。支持这两个发展程序的转录因子（图3D）和正常肾发育显著重叠（P <10-4）。这说明从正常肾发育过程中和引入的Wilms肿瘤细胞之间存在着发育关系。这揭示了Wilms细胞的可塑性和胎儿身份，并定义了细胞发育状态和轨迹以及可能存在肿瘤靶向的靶点。

 图3 UB细胞、Wilms肿瘤细胞和肾源性静息细胞的拟时轨迹

7. RCC（Renal Cell Carcinoma）与正常成熟肾脏细胞的相似性

作者研究了ccRCC、pRCC和von Hippel-Lindau病相关的ccRCC和正常成熟肾脏细胞的相似性，发现：

• 大部分RCC存在PT1细胞的转录特征，PT1细胞是旋绕的近端肾小管细胞（图4A）。

• ccRCC细胞簇（cR7）与PT3细胞相似，并且pRCC细胞表现出与Collecting duct相比更弱的匹配（图4A）。

 图4.RCC与正常成熟肾脏细胞的相似性

PT1特征代表了一种RCC细胞状态，这种状态超越了肿瘤内和肿瘤间RCC细胞的多样性。为了验证RCC中PT1特征的身份，利用ATCG中1019个可公开获得的RCC和正常组织转录组数据，分析PT1特异标记基因的表达情况；以及通过对CA9 + VCAM1 +近端肾小管细胞簇（CA9是ccRCC细胞的特异性标记物）进行共定位和免疫染色来验证。总之，这些观察结果证实了PT1细胞是与ccRCC细胞最接近的正常细胞。在ccRCC和pRCC都中存在PT1特征，这可能表明这些肿瘤具有共同起源但具有不同的发展命运。

8. 通过分析肿瘤微环境细胞，描绘血管内皮生长因子（VEGF）信号通路

作者利用肿瘤微环境中的免疫细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞和血管内皮细胞研究了血管内皮生长因子（VEGF）信号转导通路，VEGF信号也是RCC治疗中的既定目标。逐级统计VEGF信号转导中关键成分的表达，描绘不同细胞类型的转导作用和细胞之间的联络关系，并通过共聚焦显微镜和流式细胞术进行证实。

综上，大牛的研究结果可谓充实而丰满，慎密而周全，最最机智而成熟的做法乃是将自己的研究与现在最前沿的单细胞技术完美结合，分辨率从bulk瞬间飞跃到single cell，在单细胞层面的探索注定是非凡的起点，愿10x单细胞转录组测序助您科研好运！

参考文献：Young MD, Mitchell TJ, Vieira Braga FA et al. Single-cell transcriptomes from human kidneys reveal the cellular identity of renal tumors. Science. 2018 Aug 10; 361 (6402): 594-599. doi: 10.1126/science.aat1699.