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MYORG上双等位基因突变导致常染色体隐性原发性家族性脑钙化症

本研究人员利用全外显子组测序（WES）分析、Sanger测序、连锁分析、RNA表达分析和小鼠模型的综合策略，表明肌生成调节糖苷酶（MYORG）（NCBI Gene57462; NM_020702）是PFBC的一个致病基因。

1、6个常染色体隐性PFBC家系中鉴定MYORG的双等位基因突变

为确定其他家系中的致病基因，首先选择近亲家系1进行WES分析。由于该家系符合隐性遗传模式，故筛选两个患者共有而正常人中没有的纯合突变；研究家系2发现也符合隐性遗传模式，筛选在患病兄弟中有而正常姐妹没有的，具有复合杂合或纯合变异的基因。该策略发现了两个基因，MYORG（c.1328G> A [p.W443 *]和c.103A> G [p.M35V]）和SHISA6（两个错义变体）。

基因MYORG，位于染色体9p13.3上，编码714个氨基酸的蛋白质，是糖基水解酶31家族的成员。在该研究中鉴定的突变分布在MYORG基因的所有编码区中。9种与疾病相关的突变中有7种存在于内质网（ER）腔内片段中，其中3种位于糖苷酶结构域。剩余的突变p.M35V和p.W75 *分别定位于细胞质和跨膜片段（图1B）。

图1 、PFBC患者中检测到MYORG突变

MYORG为两个家系中共有的候选基因，然后对来自8个其他符合隐性遗传模式PFBC家系和3个不确定遗传模式家系的先证者进行Sanger测序。在另外四个先证者中鉴定出了MYORG中的纯合或复合杂合突变（图1A;表1）。对于其余七个家系，未检测到MYORG中任何疑似杂合或纯合的致病突变。

在上述六个家系中已鉴定出的9个MYORG突变中，三个是无义突变（p.W75 *，p.Q203 *和p.W443 *），两个是影响几个氨基酸的插入或缺失突变（ p.116_117insLAFR和p.365_366delFD），四个是位于高度保守的结构域中的错义突变。所有这些突变在1000 Genomes Project和NHLBI GO外显子组测序项目（ESP）数据库中都不存在。在gnomAD中，这些突变不存在或极低频率下杂合（表1）。

2、MYORG在星形胶质细胞ER中的特异性表达

通过原位杂交（ISH）分析小鼠脑中Myorg表达，发现其分散于整个大脑中（图2A）。尤其是Myorg表达信号富集在小脑浦肯野细胞层（PCL）内的较小神经元胞体（Bergmann glia），提高了Myorg在星形胶质细胞中特异性表达的推测（图2B）。为验证结果，将Myorg ISH与标记星形胶质细胞（S100b，GFAP）、少突胶质细胞（Ng2）和周细胞（Pdgfrb）的方法结合起来，观察到在整个脑中Myorg原位信号与S100b免疫染色的显著共定位，包括大脑皮层（图2C）和小脑（图2D）。此外，在海马体中，Myorg原位信号也与GFAP免疫染色共定位（图2F，左）。

为进一步验证该结果，构建Myorg-GFP敲入小鼠，其中GFP编码序列直接插入内源Myorg基因的ATG密码子之后；发现所有表达GFP的细胞也表达S100b（图2E）。使用双链ISH发现Myorg和Ng2的表达仅部分重叠（图2F，中间）。相反，在Myorg和Pdgfrb之间未观察到共定位（图2F，右）。总之，以上结果首次表明Myorg在S100b +星形胶质细胞中特异性表达。

为研究MYORG蛋白的亚细胞定位，将GFP标记的MYORG质粒转染到Cos-7细胞和原代培养的人星形胶质细胞中。如在两种细胞类型中与ER标记蛋白Calnexin的共定位所示（图2G，右），GFP标记的MYORG主要定位于ER。仅观察到MYORG与高尔基标记蛋白GM130的部分共定位（图2G，左图）。结果表明MYORG可以调节脑中星形胶质细胞的ER中的蛋白质糖基化。

图2、Myorg在小鼠脑中的表达及MYORG在细胞中的亚细胞定位

3、MYORG的敲除导致小鼠脑内的钙化沉积

将靶向Myorg和Cas9 mRNA的sgRNA共同注射到C57BL / 6J受精卵中。通过对Myorg基因组DNA的PCR产物进行测序来进行founder小鼠的基因分型，并在插入到T-载体中之后通过每个等位基因的单克隆测序进一步验证基因型。

从2月龄开始可检测到钙化沉积物的存在。在2-8个月龄的对照或Myorg 基因敲除小鼠中未检测到明显的脑钙化。在9个月大的Myorg纯合子敲除小鼠的大脑切片中，其中茜素红、Von Kossa和H＆E以及丘脑中的阿尔新蓝和高碘酸 - 希夫（PAS）染色呈阳性（图3A和3B中，上部），检测到双侧不规则钙化球体为球形或椭圆形，直径为10-50mm。相反，在该年龄的对照小鼠的脑中没有观察到钙化结节（图3B，下图）。

使用SEM-EDS分析结节的元素组成（图3C）。与周围组织中的碳相比，主要成分包括钙、磷和氧，表明大多数沉积的结节是磷酸钙（图3D）。Myorg基因敲除小鼠的钙化成分在元素组成上与人类相似。总之，结果表明Myorg 基因敲除小鼠脑中形成了磷酸钙沉积，进一步证实MYORG是PFBC的致病基因。

 图3、Myorg KO小鼠的脑钙化

MYORG为一个常见的PFBC基因和PFBC的第一个常染色体隐性致病基因。此外，发现小鼠中Myorg mRNA在星形胶质细胞中特异性表达，将星形胶质细胞定义为参与脑钙化的细胞类型；Myorg基因敲除小鼠在大脑中形成钙沉积，符合PFBC患者的疾病表型。

参考文献：

Yao X P, Cheng X, Wang C, et al. Biallelic Mutations in MYORG Cause Autosomal Recessive Primary Familial Brain Calcification[J]. Neuron, 2018.