dafabet手机黄金版_dafabet黄金手机版

研究方法

1. HGFs中LPS对炎性细胞因子mRNA表达的影响

为确定RNA-seq中LPS处理的浓度和时间点，在不同时间点检测1μg/ ml和10μg/ ml LPS诱导炎性细胞因子mRNA表达。与低剂量LPS（1μg/ 1）相比，高剂量LPS（10μg/ ml）诱导的IL-1β，IL-6和IL-8（CXCL-8）mRNA水平显著升高；刺激后的前期（4小时/ 6小时），1μg/ ml和10μg/ ml LPS均能诱导炎性细胞因子的单个上调峰；晚期（24小时），LPS组中IL-1β和IL-6的mRNA水平降至未刺激水平（图1）。结果表明，LPS诱导促炎基因转录过程早期促进，晚期沉默。

图1   HGFs中LPS对炎性细胞因子mRNA表达的影响

2. HGF中LPS早期反应的完整转录谱

采用RNA-SEQ方法在HGFs（4小时）中筛选出10μg/ml LPS的整个转录谱。对主成分分析发现：两个对照样品彼此接近，LPS处理的样品主要基于PC2方向分开（图2a），这可能是不同HGF对LPS反应诱导作用。分析热图中所有显著改变基因（图3b）与LPS诱导的下调基因，发现存在更多上调的基因（图2b）。

图2  HGF中对LPS的早期反应的完整转录谱

RNA-seq数据处理后，火山图显示最显著变化的基因（图3a）。经LPS刺激后发现总共204个基因发生显著变化，其中198个基因上调，而只有6个基因下调。据KEGG途径分析，其中包括22种细胞因子（10.8％）、19种NF-κB信号传导（9.3％）相关基因、10种代谢基因（4.9％）和153种其他功能性分子（75.0％）（图3b）。

图3 显著性分析选择LPS诱导的基因

3. HGF中响应LPS miRNA表达的动力学 

基于RNA-seq数据，发现miRNA-146a和miRNA-155在10μg/ ml LPS刺激后4小时出现上调（图3c）。 为探索miRNA和炎性细胞因子之间的潜在相关性，进行定量RT-PCR以验证在1μg/ ml和10μg/ ml LPS处理后的不同时间点的miRNA表达。结果显示，1μg/ ml LPS在刺激后8小时诱导miRNA-146a、-146b和-155的单一上调峰；10μg/ ml LPS在早期（2小时/ 4小时）和晚期（24小时）诱导miRNA-146a和-155表达出现上调（图4）。

图4  HGF中响应LPS miRNA表达的动力学

4. HGFs中响应LPS的趋化因子mRNA和蛋白水平的动力学

基于RNA-seq数据，趋化因子主要显著增加的分子（图3c）。定量RT-PCR的结果证实，经1μg/ ml和10μg/ ml LPS处理后，CXCL-1、-2、- 3和-5的mRNA表达在4小时达到上调峰值，而CXCL-6和-10 mRNA在6小时时显著增加；在晚期（24小时），经LPS刺激后CXCL-1、-2、-3和-10的mRNA水平下调至未刺激水平（图5）。

图5  HGFs中响应LPS的趋化因子mRNA水平动力学

使用ELISA法测定确定CXCL-2、-8和-10蛋白质水平，这些趋化因子的蛋白质表达呈时间依赖性方式增加，并且经1μg/ ml和10μg/ ml LPS刺激后维持至24小时（图6）。

图6   HGFs中响应LPS的趋化y因子蛋白质水平动力学

结论

本文通过牙龈卟啉单胞菌LPS在HGF中诱导的完整转录谱研究，发现不同剂量LPS诱导HGFs中miRNA表达出现不同，且miRNA可能在由高剂量和低剂量LPS诱导的关键炎症相关基因转录下调中起不同作用。

参考文献：

Yufeng Xie, Mengjun Sun, Yiru Xia，et al.An RNA-seq screen of P. gingivalis LPS treated human gingival fibroblasts. Archives of Oral Biology.2018,77-8.4