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转录调控客户文章 | KSRP/miR-129/RUNX1调控轴在骨髓分化中的作用
发布日期：2018-03-26浏览： 次
文章导读：本研究综合利用RNA测序、small RNA测序、体内外功能实验等，阐明了KSRP/miR-129/RUNX1调控轴在骨髓分化中的作用。KSRP调节作用与miRNA介导的转录后调节作用相似，单个miRNA可结合多个靶基因，抑制它们的表达。了解RNA结合蛋白与非编码RNA的互作，对研究者发现正常发育和复杂遗传疾病在后转录水平的作用机制有帮助。
杂志：nature communication  IF：12.124  发表时间：2017.11  
单位：中国医学科学院＆北京协和医学院
 
 主要结果 
 
1. 参与骨髓分化的RBPs鉴定
 
CD34+造血祖细胞(HPCs)分别经M-CSF和G-CSF诱导，15天后分化为单核细胞和粒细胞(Fig. 1a)。分别对分化5天、10天、15天的单核细胞和粒细胞进行RNA测序（分析流程Fig. 1b）。
差异表达分析找到21个（来自单核细胞M）和16个（来自粒细胞G）RBP基因，共有基因8个(Fig. 1c)。所有鉴定的PBP基因中KSRP引起作者关注，KSRP在粒细胞分化期间显著上调，而单核细胞分化期间显著下调 (Fig. 1g)。
 
图1 RNA测序鉴定差异表达的RBP。
 
2. KSRP在M和G分化期间表达相反，且发挥相反作用
 
作者对脐带血、骨髓CD34+ HPCs、骨髓淋巴细胞系-THP−1, NB4, HL-60进行检测，发现KSRP在M分化时逐渐下调，而在G分化时显著上调(Fig. 2a-d)。同时，对KSRP进行敲低实验做进一步验证(Fig. 2e)。表明，KSRP在骨髓M和G分化时发挥相反的作用。
 
图2 KSRP在单核细胞及粒细胞分化时具有不同的功能。
 
3. KSRP在骨髓分化中调控miRNA的生物合成
 
作者对KSRP过表达的THP-1进行RNA和small RNA测序 (Fig. 3a)，鉴定pri-miRNAs及mature miRNAs，找到16个候选分子，这些分子的生物合成过程可被KSRP促进(Fig. 3b, c)，证实了之前的报道KSRP可正调控pri-miRNA的加工。同时，过表达和敲低实验显示KSRP直接调节16个miRNAs的加工(Fig. 3d)。进一步细胞实验后，作者最终锁定pri-129-1和miR-129-5p，进行下一步研究。
 
图3 RNA测序鉴定KSRP调控的pri-miRNA
 
4. KSRP在骨髓细胞中可调节pri-129-1的加工，并与其结合
 
作者通过一系列实验验证发现，KSRP过表达后，可提高pre-129-1和miR-129的水平，降低pri-129-1的水平；而在KSRP被敲低时，结果相反(Fig. 4e)，说明KSRP可调节pri-129-1的加工过程。
通过RNAfold软件找到了KSRP与pri-129-1的4个结合位点 (Fig. 5a)，并经RIP实验证实(Fig. 5b)。RNA pull down实验显示KSRP与pri-129-1的结合具有特异性。将4个结合位点分别突变后进行分析，发现位点1,2,4可与KSRP特异性的结合(Fig. 5h)。
 
图4 KSRP在骨髓细胞中调节pri-miRNA的加工
 
图5 在骨髓细胞中KSRP与pri-129-1结合
 
5. KSRP在体内和体外均可促进pri-129-1的加工
 
根据已有的报道，作者推测KSRP对pri-129-1的加工，是否是KSRP与Drosha形成复合体而进行调控(Fig. 6a)。Co-IP实验证实了此假设(Fig. 6b)。RIP-RT-PCR显示KSRP可特异性地促进Drosha-DGCR8与靶标pri-miRNAs结合(Fig. 6c)。分别对129_WT和129_Mut进行加工，当KSRP蛋白增加时可提高129_WT的裂解效率，而对129_Mut影响轻微(Fig. 6f)。当KSRP被干扰时又可减弱pri-129-1的加工(Fig. 6g, h)。因此，KSRP与Drosha-DGCR8的复合体可促进pri-129-1的加工。体外实验同样验证了体内实验的结果。
 
图6 KSRP在体外可促进pri-129-1的加工
 
6. miR-129调控骨髓分化，并且直接靶向调控RUNX1
 
功能获得和缺失实验显示miR-129抑制单核细胞分化，促进粒细胞分化(Fig. 8a, b)。生物学预测发现RUNX1是miR-129的靶基因，荧光素酶报告实验证实miR-129直接靶向调控RUNX1 (Fig. 9b)。与miR-129相反，RUNX1在M分化中上调，G分化中下调 (Fig. 9c)。同样，通过过表达和敲低实验发现RUNX1促进单核细胞分化，抑制粒细胞分化(Fig. 9g)。
 
图8 miR-129调节单核细胞和粒细胞的分化
 
图9 miR-129靶向RUNX1，调节骨髓细胞分化
 
7. 骨髓分化中的KSRP/miR-129/RUNX1 axis
 
基于以上结果，作者假设KSRP、miR-129、RUNX1形成一个调节轴来调控骨髓分化 (Fig. 10e)。敲低KSRP可提高pri-129的水平，降低成熟体miR-129的水平 (Fig. 10f)。同时，miR-129过表达可抑制RUNX1的表达 (Fig. 10g)。所以，KSRP的敲低进一步提高RUNX1的表达 (Fig. 10h)。总之，KSRP和miR-129在成熟血细胞中同时表达，它们的高表达有利于粒细胞成熟，低表达有利于单核细胞的成熟。
 
图10  KSRP和miR-129在体内调节单核细胞和粒细胞的分化
 
参考文献：Zhao H, Wang X, Yi P, et al. KSRP specifies monocytic and granulocytic differentiation through regulating miR-129 biogenesis and RUNX1 expression[J]. Nature communications, 2017, 8(1): 1428.
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