相信通过上期的介绍，大家对RAP都有了一定的了解，RAP技术是通过生物素标记的反义寡核苷酸探针来捕获其杂交的靶RNA，纯化后即可得到内源RNA及与之相结合的蛋白及核酸，将RAP技术与测序或质谱相结合，可以研究RNA与染色质的互作，鉴定与RNA相互作用的蛋白，在转录组层面上研究多种RNA间的转录调控关系。
本期，我们将通过一篇文章来具体讨论RAP在转录调控中的实际应用，文章于2017年发表在Arch Toxicol上，影响因子5.9。此次分享的这篇RAP应用文章，研究思路清晰，易于理解，可作为转录组相关研究课题设计的范本。
一、研究简介
本文旨在研究非编码RNA在铅诱导神经中毒中的作用。研究人员在铅诱导神经中毒小鼠模型中探究了lncRNA和circRNA的重要功能。通过高通量测序等技术发现lncRpa和circRar1促进神经细胞凋亡。利用RAP等实验手段发现lncRpa、circRar1可以通过与miR-671直接作用调控凋亡相关因子的表达水平，促进细胞凋亡。本研究首次发现lncRNA，circRNA，miRNA及凋亡基因共同构成了调控网络，并介导铅诱导的神经中毒细胞的凋亡。
二、研究思路
本文主线思路非常清晰，普遍适用于转录组测序之后基因功能研究（图1）。首先构建实验模型，然后用高通量测序技术筛选到目标分子（lncRpa和circRar1），接下来探究目标分子的功能，最后深入挖掘其发挥功能的分子机制。如果发现的分子有重要的生物学过程功能，再通过分子机制的挖掘把整个过程串起来，论述清楚，发表好文章指日可待。
图1 文章主线研究思路
三、主要内容
图2 文章主要内容流程图
本文研究的主要内容如图2流程图，下面对文章的内容展开介绍：
1. 铅诱导神经中毒小鼠中差异表达lncRNA和circRNA的鉴定
研究人员建立铅诱导神经中毒的小鼠模型和细胞模型。通过对小鼠脑组织进行转录组测序分析得到重要的3个lncRNA（lncRpa，lncRNA Gm16025，lncRNA Gm14260）和2个circRNA（circRar1、Trerf1）。选择qRT-PCR在不同类型的脑组织和细胞模型中对这5个RNA分子进行验证。结果发现，lncRpa和circRar1在多种脑组织和细胞模型中显著上调，可能起到重要作用（图3）。
图3 不同类型脑组织 和细胞的qRT-PCR验证
2. lncRpa和circRar1促进铅诱导神经中毒细胞的凋亡
为了进一步探究lncRpa和circRar1的功能，作者分别对这两种分子进行过表达和敲除，并通过流式细胞术和TUNEL等实验检测对细胞凋亡的影响。结果表明，铅处理导致细胞的凋亡率升高，敲除lncRpa和circRar1后，可以部分恢复铅诱导的细胞凋亡。而过表达lncRpa和circRar1则会使细胞的凋亡加剧（图4）。因此，lncRpa和circRar1促进了铅诱导神经中毒细胞的凋亡。
图4 细胞凋亡率的定量分析
3. lncRpa/circRar1与miR-671发生直接的相互作用
为了探究lncRpa和circRar1作用的分子机制，作者首先应用FISH技术对这两种分子进行细胞定位，发现它们都位于细胞质，表明它们应该是通过转录后调控发挥作用。随后，应用多个miRNA数据库预测与这两种分子直接相互作用的miRNA，找到同时与两种分子发生相互作用的miRNA（miR-671和miR-218）。接下来，作者将RAP技术与转录组测序结合分析发现miR-671是两种分子唯一共同的靶标。然后，对RAP下来的RNA进行了qRT-PCR和凝胶电泳检测。结果表明，RAP组检测发现了miR-671，但没有检测到miR-218的存在（图5）。此外，qRT-PCR结果表明，RAP之后lncRpa/circRar1与miR-671直接结合，而阴性对照没有（图6）。最后，分别对三种分子进行过表达和敲除实验，发现lncRpa和circRar1的表达正相关，而miR-671与lncRpa/circRar1的表达呈负调控关系（图7）。
图5 RAP鉴定目标miRNA
图6 荧光定量验证RAP之后RNA间的相互作用
图7 lncRpa, circRar1和miR-671间的相互作用关系
4. lncRpa和circRar1通过调控凋亡相关因子的表达诱导细胞凋亡
为了解新分子miR-671在铅诱导神经中毒中的作用，研究人员通过荧光定量检测发现miR-671在神经中毒的细胞和组织中表达是下调的。凋亡检测的结果表明，miR-671可以抑制细胞凋亡。通过对miR-671进行靶基因预测发现了5个凋亡相关基因：Akt2，caspase8，p38，MAX和RASGRF1。分别敲除和过表达miR-671后检测对凋亡相关基因表达的影响，结果发现caspase8和p38的表达与miR-671的表达呈负相关，且这两个基因是促进细胞凋亡的因子。
最后，为了确认lncRpa和circRar1的促凋亡机制，作者还验证了lncRpa，circRar1与上述凋亡相关因子的关系。同样，通过基因敲除和过表达实验发现caspase8和p38的表达随着lncRpa和circRar1表达的改变而改变，且趋势一致（图8）。综上所述，lncRpa和circRar1可以通过miR-671调控凋亡相关因子的表达，从而诱导细胞凋亡。
图8 lncRpa和circRar1对凋亡相关因子表达的影响
四、讨论
1. 这篇文章研究思路清晰，容易理解，可作为转录组相关研究课题设计的范本。
2. 本文对测序结果的描述比较简单，重点在于基因功能的研究，可能存在其他发表的文章。一般来说，测序分析部分可以展开讨论，论述筛选过程，使文章内容更为丰富。
3. 从内容上看，本文只做了lncRNA和circRNA测序，后续miRNA和mRNA的研究都是通过预测来研究的。随着测序价格越来越便宜，这里完全可以做一个全转录组测序，获得所有mRNA和非编码RNA信息，通过关联分析，可以直接得到相互间的调控关系，使文章更有说服力，也可以为后续研究提供更多的方向。
4. RAP技术适用于RNA间相互作用的验证，因此是转录组研究的有利工具。将RAP与qRT-PCR等技术结合，可以直接验证两个RNA分子间的相互作用。而将RAP与转录组测序相结合，可以广泛筛选与目标分子相互作用的RNA分子，便于开展后续研究。
参考文献：
Nan A, Chen L, Zhang N, et al. A novel regulatory network among LncRpa, CircRar1, MiR-671 and apoptotic genes promotes lead-induced neuronal cell apoptosis[J]. Archives of toxicology, 2017, 91(4): 1671-1684.
Nan A, Chen L, Zhang N, et al. A novel regulatory network among LncRpa, CircRar1, MiR-671 and apoptotic genes promotes lead-induced neuronal cell apoptosis[J]. Archives of toxicology, 2017, 91(4): 1671-1684.相信通过上期的介绍，大家对RAP都有了一定的了解，RAP技术是通过生物素标记的反义寡核苷酸探针来捕获其杂交的靶RNA，纯化后即可得到内源RNA及与之相结合的蛋白及核酸，将RAP技术与测序或质谱相结合，可以研究RNA与染色质的互作，鉴定与RNA相互作用的蛋白，在转录组层面上研究多种RNA间的转录调控关系。
本期，我们将通过一篇最新文章来具体讨论RAP在转录调控中的实际应用，文章于2017年发表在Arch Toxicol上，影响因子5.9。此次分享的这篇RAP应用文章，研究思路清晰，易于理解，可作为转录组相关研究课题设计的范本。
一、研究简介
本文旨在研究非编码RNA在铅诱导神经中毒中的作用。研究人员在铅诱导神经中毒小鼠模型中探究了lncRNA和circRNA的重要功能。通过高通量测序等技术发现lncRpa和circRar1促进神经细胞凋亡。利用RAP等实验手段发现lncRpa、circRar1可以通过与miR-671直接作用调控凋亡相关因子的表达水平，促进细胞凋亡。本研究首次发现lncRNA，circRNA，miRNA及凋亡基因共同构成了调控网络，并介导铅诱导的神经中毒细胞的凋亡。
二、研究思路
本文主线思路非常清晰，普遍适用于转录组测序之后基因功能研究（图1）。首先构建实验模型，然后用高通量测序技术筛选到目标分子（lncRpa和circRar1），接下来探究目标分子的功能，最后深入挖掘其发挥功能的分子机制。如果发现的分子有重要的生物学过程功能，再通过分子机制的挖掘把整个过程串起来，论述清楚，发表好文章指日可待。
图1 文章主线研究思路
三、主要内容
图2 文章主要内容流程图
本文研究的主要内容如图2流程图，下面对文章的内容展开介绍：
1. 铅诱导神经中毒小鼠中差异表达lncRNA和circRNA的鉴定
研究人员建立铅诱导神经中毒的小鼠模型和细胞模型。通过对小鼠脑组织进行转录组测序分析得到重要的3个lncRNA（lncRpa，lncRNA Gm16025，lncRNA Gm14260）和2个circRNA（circRar1、Trerf1）。选择qRT-PCR在不同类型的脑组织和细胞模型中对这5个RNA分子进行验证。结果发现，lncRpa和circRar1在多种脑组织和细胞模型中显著上调，可能起到重要作用（图3）。
图3 不同类型脑组织 和细胞的qRT-PCR验证
2. lncRpa和circRar1促进铅诱导神经中毒细胞的凋亡
为了进一步探究lncRpa和circRar1的功能，作者分别对这两种分子进行过表达和敲除，并通过流式细胞术和TUNEL等实验检测对细胞凋亡的影响。结果表明，铅处理导致细胞的凋亡率升高，敲除lncRpa和circRar1后，可以部分恢复铅诱导的细胞凋亡。而过表达lncRpa和circRar1则会使细胞的凋亡加剧（图4）。因此，lncRpa和circRar1促进了铅诱导神经中毒细胞的凋亡。
图4 细胞凋亡率的定量分析
3. lncRpa/circRar1与miR-671发生直接的相互作用
为了探究lncRpa和circRar1作用的分子机制，作者首先应用FISH技术对这两种分子进行细胞定位，发现它们都位于细胞质，表明它们应该是通过转录后调控发挥作用。随后，应用多个miRNA数据库预测与这两种分子直接相互作用的miRNA，找到同时与两种分子发生相互作用的miRNA（miR-671和miR-218）。接下来，作者将RAP技术与转录组测序结合分析发现miR-671是两种分子唯一共同的靶标。然后，对RAP下来的RNA进行了qRT-PCR和凝胶电泳检测。结果表明，RAP组检测发现了miR-671，但没有检测到miR-218的存在（图5）。此外，qRT-PCR结果表明，RAP之后lncRpa/circRar1与miR-671直接结合，而阴性对照没有（图6）。最后，分别对三种分子进行过表达和敲除实验，发现lncRpa和circRar1的表达正相关，而miR-671与lncRpa/circRar1的表达呈负调控关系（图7）。
图5 RAP鉴定目标miRNA
图6 荧光定量验证RAP之后RNA间的相互作用
图7 lncRpa, circRar1和miR-671间的相互作用关系
4. lncRpa和circRar1通过调控凋亡相关因子的表达诱导细胞凋亡
为了解新分子miR-671在铅诱导神经中毒中的作用，研究人员通过荧光定量检测发现miR-671在神经中毒的细胞和组织中表达是下调的。凋亡检测的结果表明，miR-671可以抑制细胞凋亡。通过对miR-671进行靶基因预测发现了5个凋亡相关基因：Akt2，caspase8，p38，MAX和RASGRF1。分别敲除和过表达miR-671后检测对凋亡相关基因表达的影响，结果发现caspase8和p38的表达与miR-671的表达呈负相关，且这两个基因是促进细胞凋亡的因子。
最后，为了确认lncRpa和circRar1的促凋亡机制，作者还验证了lncRpa，circRar1与上述凋亡相关因子的关系。同样，通过基因敲除和过表达实验发现caspase8和p38的表达随着lncRpa和circRar1表达的改变而改变，且趋势一致（图8）。综上所述，lncRpa和circRar1可以通过miR-671调控凋亡相关因子的表达，从而诱导细胞凋亡。
图8 lncRpa和circRar1对凋亡相关因子表达的影响
四、讨论
1. 这篇文章研究思路清晰，容易理解，可作为转录组相关研究课题设计的范本。
2. 本文对测序结果的描述比较简单，重点在于基因功能的研究，可能存在其他发表的文章。一般来说，测序分析部分可以展开讨论，论述筛选过程，使文章内容更为丰富。
3. 从内容上看，本文只做了lncRNA和circRNA测序，后续miRNA和mRNA的研究都是通过预测来研究的。随着测序价格越来越便宜，这里完全可以做一个全转录组测序，获得所有mRNA和非编码RNA信息，通过关联分析，可以直接得到相互间的调控关系，使文章更有说服力，也可以为后续研究提供更多的方向。
4. RAP技术适用于RNA间相互作用的验证，因此是转录组研究的有利工具。将RAP与qRT-PCR等技术结合，可以直接验证两个RNA分子间的相互作用。而将RAP与转录组测序相结合，可以广泛筛选与目标分子相互作用的RNA分子，便于开展后续研究。
参考文献：
Nan A, Chen L, Zhang N, et al. A novel regulatory network among LncRpa, CircRar1, MiR-671 and apoptotic genes promotes lead-induced neuronal cell apoptosis[J]. Archives of toxicology, 2017, 91(4): 1671-1684.
