转录调控研究的新武器——RAP
RAP（RNA Antisense Purification）通过生物素标记的反义寡核苷酸探针来捕获其杂交的靶RNA，纯化后即可得到内源RNA及与之相结合的蛋白及核酸，这是研究RNA与DNA，RNA与蛋白，RNA与RNA相互作用的一种新方法。将RAP与测序或质谱技术结合，可以研究RNA与染色质的互作，鉴定与RNA相互作用的蛋白，在转录组层面上研究多种RNA间的转录调控关系，因此RAP可作为转录调控分子机制研究的新武器。
为了帮助大家更详尽的了解RAP技术，dafabet黄金手机版小编精心准备了2篇关于RAP技术的文章，以RAP技术的发展为主线，从技术介绍到案例分析，为您全方位解读RAP应用。
RAP起源：lncRNA-染色质的相互作用
哺乳动物基因组编码数千种长链非编码RNA（lncRNA），这些lncRNA在细胞中有着重要的生物学功能。研究表明lncRNA可以通过识别基因组靶位点，与染色质发生相互作用来调控基因的表达，但机制尚不清楚。为此，加州理工学院Guttman博士团队开发出了一项新技术来研究lncRNA与染色质的相互作用。该技术即为RAP（RNA Antisense Purification），是一种应用生物素标记的反义寡核苷酸捕获目标RNA，从而研究与特定的RNA相互作用的DNA的技术。其主要技术流程如下： a. 针对目标RNA设计反义寡核苷酸探针，并合成探针；b. 细胞交联，溶解细胞，并打断DNA；c. 将生物素标记的探针与核酸复合物一起孵育；d. 洗脱、纯化之后，进行测序分析（图1）。
图1 RAP简要技术流程（Engreitz J M, Pandya-Jones A, McDonel P, et al.）
2013年science[1]杂志上，Guttman团队首次提出了RAP技术，并将其成功应用于目前研究最广泛的lncRNA——Xist的研究。众所周知，Xist是参与X染色体沉默的一种lncRNA分子，虽然对其功能已经非常了解，但Xist沉默X染色体的分子机制尚不明确。在该研究中，Guttman团队首先论证了RAP技术的可行性，随后用该方法探究了Xist在X染色体失活过程中的基因组定位及其迁移方式。结果发现，Xist可以识别三维基因组结构，通过改变染色质的空间结构来逐步迁移，并沉默整条X染色体。Guttman说，RAP令人激动的地方不仅仅是解释了Xist的运作机制，而是RAP技术也普遍适用于其他lncRNA研究。
RAP发展：lncRNA-蛋白质的相互作用
在将RAP技术应用于lncRNA与染色质的相互作用的研究之后，Guttman团队并没有停下研究的脚步，他们与Broad研究所合作在nature上[2]发文，表明RAP技术同样适用于研究RNA与蛋白质的相互作用。新研究仍是探究Xist的分子机制，但重点放在了参与X染色体沉默的蛋白。为了找到与Xist直接作用的蛋白，研究人员对RAP技术进行了改进，主要体现在两方面：交联和纯化方式。交联由原来的化学交联改成了紫外交联，紫外交联能使RNA与蛋白之间形成稳定的共价连接。而纯化的方式则改成了去除非共价连接的变性条件，以便保留与RNA形成共价连接的蛋白。纯化得到RNA复合物之后，用定量质谱分析法就可以获得与RNA相互作用的蛋白（图2）。根据新建立的RAP-MS技术，该研究发现SHARP蛋白会与Xist发生直接的相互作用，且通过招募SMRT，激活HDAC3，抑制RNA聚合酶II的结合等方式沉默基因表达。
图2 RNA-蛋白质互作技术流程（McHugh C A, Chen C K, Chow A, et al.）
RAP延伸：RNA-RNA间的相互作用
随着转录调控研究的不断深入，RNA-RNA间的相互作用越来越受到重视，lncRNA、miRNA、circRNA及mRNA间可以通过ceRNA等相互作用机制调控生物体内复杂的生物学过程。RAP技术是否也可以应用于RNA-RNA间相互作用的研究呢？2014年发表于cell[3]的一篇文章论述了RAP技术在RNA间相互作用研究的应用。鉴于RNA间相互作用分为直接和间接作用两种，研究人员根据之前建立的RAP技术流程，开发出了三种新的实验流程：RAP-RNA[AMT], RAP-RNA[FA]和 RAP-RNA[FA-DSG]。这三种方法的主要区别在于交联方法的不同（图3）： RAP-RNA[AMT]用的是AMT（4’-aminomethyltrioxalen），一种补骨脂素衍生物交联剂，可以使RNA与RNA间通过尿苷产生交联，适用于直接的RNA-RNA相互作用。RAP-RNA[FA]用的交联剂是FA（formaldehyde），可以同时交联RNA-RNA和RNA-蛋白，因此适用于同时研究RNA间的直接和间接相互作用。而RAP-RNA[FA-DSG]在FA的基础上，又添加了DSG（disuccinimidyl glutarate），一种强蛋白交联剂，更适用于RNA间通过多个蛋白连接的情况。这三种方法覆盖了所有RNA间相互作用的情况，研究者可以根据其研究目的选择最合适的方法来应用。
图3 三种RAP-RNA方法的区别（Engreitz J M, Sirokman K, McDonel P, et al.）
转录调控研究中，lncRNA-mRNA，miRNA-mRNA等通过序列互补直接结合的情况比较常见，因此RAP-RNA[AMT]的应用可能更为广泛。以U1 snRNA为例，RAP-RNA[AMT]的实验流程见图,4，主要步骤为：a. 设计并合成生物素标记的探针；b. 用AMT交联细胞；C. 裂解细胞，消化蛋白和DNA，片段化RNA；d. 将探针与RNA杂交；e. 洗脱RNA复合物，纯化RNA后进行测序分析。在RAP-RNA实验之后，通过qRT-PCR和二代测序等技术，可以研究与目标RNA相互作用的RNA，探究更深层的转录调控机制。
dafabet手机黄金版最新推出RAP-RNA整体研究方案，可与全转录组测序技术相结合，在转录水平上研究lncRNA-mRNA，miRNA-mRNA，circRNA-mRNA等RNA间的相互作用，探究参与重要生命活动的潜在调控网络，助力您发表高分文章。
图4 RAP-RNA[AMT]的实验流程（Engreitz J M, Sirokman K, McDonel P, et al.）
下一期，小编将通过一个具体的案例来探究RAP在转录调控中的实际应用，该研究思路清晰、易于理解，可作为转录组相关研究课题设计的范本。敬请期待。
参考文献
[1] Engreitz J M, Pandya-Jones A, McDonel P, et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X chromosome[J]. Science, 2013, 341(6147): 1237973.
[2] McHugh C A, Chen C K, Chow A, et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3[J]. Nature, 2015, 521(7551): 232-236.
[3] Engreitz J M, Sirokman K, McDonel P, et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites[J]. Cell, 2014, 159(1): 188-199.
RAP（RNA Antisense Purification）通过生物素标记的反义寡核苷酸探针来捕获其杂交的靶RNA，纯化后即可得到内源RNA及与之相结合的蛋白及核酸，这是研究RNA与DNA，RNA与蛋白，RNA与RNA相互作用的一种新方法。将RAP与测序或质谱技术结合，可以研究RNA与染色质的互作，鉴定与RNA相互作用的蛋白，在转录组层面上研究多种RNA间的转录调控关系，因此RAP可作为转录调控分子机制研究的新武器。
为了帮助大家更详尽的了解RAP技术，dafabet黄金手机版小编精心准备了2篇关于RAP技术的文章，以RAP技术的发展为主线，从技术介绍到案例分析，为您全方位解读RAP应用。
RAP起源：lncRNA-染色质的相互作用
哺乳动物基因组编码数千种长链非编码RNA（lncRNA），这些lncRNA在细胞中有着重要的生物学功能。研究表明lncRNA可以通过识别基因组靶位点，与染色质发生相互作用来调控基因的表达，但机制尚不清楚。为此，加州理工学院Guttman博士团队开发出了一项新技术来研究lncRNA与染色质的相互作用。该技术即为RAP（RNA Antisense Purification），是一种应用生物素标记的反义寡核苷酸捕获目标RNA，从而研究与特定的RNA相互作用的DNA的技术。其主要技术流程如下： a. 针对目标RNA设计反义寡核苷酸探针，并合成探针；b. 细胞交联，溶解细胞，并打断DNA；c. 将生物素标记的探针与核酸复合物一起孵育；d. 洗脱、纯化之后，进行测序分析（图1）。
图1 RAP简要技术流程（Engreitz J M, Pandya-Jones A, McDonel P, et al.）
2013年science[1]杂志上，Guttman团队首次提出了RAP技术，并将其成功应用于目前研究最广泛的lncRNA——Xist的研究。众所周知，Xist是参与X染色体沉默的一种lncRNA分子，虽然对其功能已经非常了解，但Xist沉默X染色体的分子机制尚不明确。在该研究中，Guttman团队首先论证了RAP技术的可行性，随后用该方法探究了Xist在X染色体失活过程中的基因组定位及其迁移方式。结果发现，Xist可以识别三维基因组结构，通过改变染色质的空间结构来逐步迁移，并沉默整条X染色体。Guttman说，RAP令人激动的地方不仅仅是解释了Xist的运作机制，而是RAP技术也普遍适用于其他lncRNA研究。
RAP发展：lncRNA-蛋白质的相互作用
在将RAP技术应用于lncRNA与染色质的相互作用的研究之后，Guttman团队并没有停下研究的脚步，他们与Broad研究所合作在nature上[2]发文，表明RAP技术同样适用于研究RNA与蛋白质的相互作用。新研究仍是探究Xist的分子机制，但重点放在了参与X染色体沉默的蛋白。为了找到与Xist直接作用的蛋白，研究人员对RAP技术进行了改进，主要体现在两方面：交联和纯化方式。交联由原来的化学交联改成了紫外交联，紫外交联能使RNA与蛋白之间形成稳定的共价连接。而纯化的方式则改成了去除非共价连接的变性条件，以便保留与RNA形成共价连接的蛋白。纯化得到RNA复合物之后，用定量质谱分析法就可以获得与RNA相互作用的蛋白（图2）。根据新建立的RAP-MS技术，该研究发现SHARP蛋白会与Xist发生直接的相互作用，且通过招募SMRT，激活HDAC3，抑制RNA聚合酶II的结合等方式沉默基因表达。
图2 RNA-蛋白质互作技术流程（McHugh C A, Chen C K, Chow A, et al.）
RAP延伸：RNA-RNA间的相互作用
随着转录调控研究的不断深入，RNA-RNA间的相互作用越来越受到重视，lncRNA、miRNA、circRNA及mRNA间可以通过ceRNA等相互作用机制调控生物体内复杂的生物学过程。RAP技术是否也可以应用于RNA-RNA间相互作用的研究呢？2014年发表于cell[3]的一篇文章论述了RAP技术在RNA间相互作用研究的应用。鉴于RNA间相互作用分为直接和间接作用两种，研究人员根据之前建立的RAP技术流程，开发出了三种新的实验流程：RAP-RNA[AMT], RAP-RNA[FA]和 RAP-RNA[FA-DSG]。这三种方法的主要区别在于交联方法的不同（图3）： RAP-RNA[AMT]用的是AMT（4’-aminomethyltrioxalen），一种补骨脂素衍生物交联剂，可以使RNA与RNA间通过尿苷产生交联，适用于直接的RNA-RNA相互作用。RAP-RNA[FA]用的交联剂是FA（formaldehyde），可以同时交联RNA-RNA和RNA-蛋白，因此适用于同时研究RNA间的直接和间接相互作用。而RAP-RNA[FA-DSG]在FA的基础上，又添加了DSG（disuccinimidyl glutarate），一种强蛋白交联剂，更适用于RNA间通过多个蛋白连接的情况。这三种方法覆盖了所有RNA间相互作用的情况，研究者可以根据其研究目的选择最合适的方法来应用。
图3 三种RAP-RNA方法的区别（Engreitz J M, Sirokman K, McDonel P, et al.）
转录调控研究中，lncRNA-mRNA，miRNA-mRNA等通过序列互补直接结合的情况比较常见，因此RAP-RNA[AMT]的应用可能更为广泛。以U1 snRNA为例，RAP-RNA[AMT]的实验流程见图4，主要步骤为：a. 设计并合成生物素标记的探针；b. 用AMT交联细胞；C. 裂解细胞，消化蛋白和DNA，片段化RNA；d. 将探针与RNA杂交；e. 洗脱RNA复合物，纯化RNA后进行测序分析。在RAP-RNA实验之后，通过qRT-PCR和二代测序等技术，可以研究与目标RNA相互作用的RNA，探究更深层的转录调控机制。
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图4 RAP-RNA[AMT]的实验流程（Engreitz J M, Sirokman K, McDonel P, et al.）
下一期，小编将通过一个具体的案例来探究RAP在转录调控中的实际应用，该研究思路清晰、易于理解，可作为转录组相关研究课题设计的范本。敬请期待。
参考文献
[1] Engreitz J M, Pandya-Jones A, McDonel P, et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X chromosome[J]. Science, 2013, 341(6147): 1237973.
[2] McHugh C A, Chen C K, Chow A, et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3[J]. Nature, 2015, 521(7551): 232-236.
[3] Engreitz J M, Sirokman K, McDonel P, et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites[J]. Cell, 2014, 159(1): 188-199.
