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本文于2017年发表在《Microbiome》（IF=9.000）上。以小鼠皮肤微生物群落结构特征为表型，采用QTL图谱的方法，研究小鼠基因组与皮肤微生物之间的相互作用。

摘要

背景：在近期的研究中，利用QTL图谱研究宿主基因组对个体菌群差异的影响备受关注。在此前的研究中，也证实了皮肤微生物与肠道微生物组相似，会显著性的受到宿主基因组变化的影响。

本研究中，对第15代高代杂交小鼠的皮肤微生物组进行分析，采用新方法对展现菌群相对丰度和活性的16s rRNA基因拷贝（DNA）和转录水平（RNA）进行研究。

结果：值得注意的是，结合高度重组个体和53,203个SNP位点信息使得基因间隔小至含有单个基因的<0.1Mb碱基的识别成为可能。此外，包含16s rRNA转录水平的图谱明显提高了显著相关性的检出数量，在DNA和RNA水平，分别有5个和21个显著性的SNP-细菌性状相关。重要的是，鉴定出的基因间隔含有许多涉及皮肤炎症和癌症相关的基因，该发现在已知基因毒性和益生菌潜能的情况下，受这些基因影响的细菌呈现的特性所证实。

结论：上述结果证实，基于菌群成员的相对活性水平模式很大程度上加强了检测宿主及其相关微生物之间相互关系检测的能力。最后，在皮肤癌上鉴定出的一些基因表明，与结肠癌相似，定殖微生物可能在皮肤癌的易感性和潜在预防及治疗中起作用。

材料方法

1. MRL/MpJ, NZM2410/J, BXD2/TyJ, CAST/EiJ小鼠进行高代杂交，取15代高代杂交小鼠（均龄5.9月）用于本实验，共计270只小鼠（98只公鼠；172只母鼠）。

2. 小鼠左耳同区域取微生物样，抽提总DNA和总RNA。

3. 16s rRNA扩增V1-V2（27F-338R）区域进行微生物群落鉴定分析,每个样本取3500条序列（其中一例样本3134条序列）。

4. SourceTracker analysis对属种水平的OTU进行来源分析。

5. 统计核心衡量微生物用于QTL定位。

6. 取小鼠肝脏组织对子代及4个亲本进行SNP分型（芯片）及单倍型构建。

7. 核心平衡菌群建立（CMM），共计92个分类及44个OTU单元统计在内。

8. 取小鼠肝脏样本抽提DNA，利用MegaMuga (Illumina)芯片，进行SNP基因分型并构建单倍型。绘制连锁图谱，

9. 从270只测试小鼠中随机抽取80只的样本进行QPCR,对β-变形菌，变形菌，链球菌及总细菌进行定量。

10. 在富集分析中，进行通路及基因本体富集分析。

研究结果

1. AIL作图群体的皮肤微生物组构成。研究者认为，由于皮肤微生物极易受到环境因素干扰，所以从RNA水平分析能够更保真的展示宿主与微生物之间的相互关系。研究中同时对微生物组的DNA和RNA样本进行16s研究，以确定驻留微生物和活跃微生物类群（Fig.1）。研究发现在门和属水平，微生物的平均相对丰度在DNA和RNA水平之间存在较大差异性（Table.1）。其中，变形菌门无论在驻留组还是在活跃组都是丰度最高的物种。

                   Fig. 1 Relative abundances of phyla and genera.

为了明确单个物种在DNA水平和RNA水平上的丰度差异性，研究开展了相关性分析。结果发现，在大多数丰度较高的一些物种中，相关性是不显著甚至较差的：在Proteobacteria, Bacteroidetes, unclassified Lachnospiraceae, unclassified Clostridiales, 以及Staphylococcus中，相关性显著；而Firmicutes在两者间无相关性（Fig.2）。这表明物种的存在和活性在个体及群体水上是存在较大差异性的。

此外，研究中也对G4哈G15代小鼠的皮肤微生物进行了比较。发现，尽管大部分微生物比较一致，但在物种构成上还是存在一些显著地差别：G4群体受厚壁菌门影响较大而G15群体中则是变形菌门为主（Fig.3a-c）。

Fig. 2 Correlation between standing and active relative abundances for representative taxa.  

Fig. 3 Comparison of skin microbiota composition between G4 and G15 populations.

2. 核心衡量微生物（CMM）的变异模式。在G15群体中获得92个核心和能量微生物物种及44个种水平OTU。这些CMM丰度占到研究中微生物OTU丰度占比的60%.为明确CMM在不同个体间的差异性，研究中对驻留群体及活性群体进行统计发现，丰度越高的CMM在个体中出现的越集中，反之，丰度越低的类群分布则较分散。

3. 为了衡量分笼环境、性别，年龄对CMM在个体间差异的影响，研究中利用这三者构建混合效应模型进行研究。在驻留群体中，分笼环境的造成的变化比在活跃群体中更为显著。性别及年龄因素的影响也比较类似，不过这两种因素对活跃群体的变化贡献度较高。此外，其他一些因素对CMM的差异性也有重要的影响（Additional file）。

4. G15群体的皮肤微生物QTL作图。对136个CMM物种相关的宿主基因组相关位点开展QTL定位分析，在驻留及活性群体研究中共发现13个显著性相关位点（P<0.05）和12个提示性相关位点（P<0.1）（Fig.4）。其中21个QTL位点与活跃群体相关，这些位点与驻留群体的相关位点无重叠。

Fig. 4 QTL mapping of the standing and active microbiota in the G15 population.

为了进一步探讨这种方法的可靠性，研究中选用与三种细菌相关的QTL位点在80只随机抽取的小鼠中进行QPCR的验证。结果显示以菌群为表型的方法是可靠的。即便在两批样本中微生物五种不同，研究中还是找到了G4及G15样本中都相关的4个基因区域。

5. 对候选区域的分析。分析得到的候选集因大致分为五类：免疫应答，病毒与细菌互作，皮肤发育过程，自身免疫性疾病易感性及皮肤癌症易感性。其中，后两类基因的频率最高。图5展示了与驻留菌群变形菌纲及活跃菌群b-变形菌相关的两个候选区域及其中的单基因信息（Cdh13和Nell2）。这两个基因都有报道与皮肤相关疾病有关。

讨论：本研究中，首次对小鼠基因组中皮肤微生物相关特征进行了高分辨率基因图谱的绘制。虽然整体上看，两个实验群体G4和G15之间可重复性不高，但依旧有5个基因区域证实了两个群体间的共性特征。一方面利用高密度标记和高杂群体作图成为可能，另一方面研究中也注意到，在以微生物为表性特征进行QTL作图进行宿主基因组和微生物之间互作关系研究的话，基于16SrRNA的结果可能更有效。

参考文献：Belheouane M, Gupta Y, Künzel S, et al. Improved detection of gene-microbe interactions in the mouse skin microbiota using high-resolution QTL mapping of 16S rRNA transcripts[J]. Microbiome, 2017, 5(1): 59.