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导读

单细胞转录组测序备受关注，其中单细胞RNA的制备十分重要。目前已有各种相关制备流程的报道，但都需要新鲜材料，严重限制了方案设计。特别是，需要立即采样处理，阻碍了复杂的研究设计（例如在未进入单细胞分离设备之前，设置时间梯度研究或不同取样点）。

本次分享的文章中，研究者描述了一种保持活性单细胞转录本的样本保存方法，允许后续处理步骤中中断取样时间和地点。这大大拓宽了单细胞转录组学应用的范围，并可能引起未来研究设计的模式转变。

>>> 关键词

单细胞转录组测序，MARS-Seq，Smart-seq2，低温保存，外周血单核细胞，患者来源的原位异种移植

>>> 一种样本冻存方法

细胞或组织重悬于冷冻溶液

（细胞：10％DMSO；10％热灭活FBS；80％DMEM；组织：10％DMSO，90％非灭活FBS）

↓

将细胞/组织以逐渐降低的温度（1℃/min）冷冻至-80℃

↓

液氮或-80℃储存一周

>>> 四种样本类型

· 细胞系样本

· 外周血样本

· 原发结肠样本

· 原位肿瘤植入样本

>>> 研究结果

研究人员首先测试了用冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）保存的细胞是否适合单细胞基因组学实验流程。采用MARS-Seq法样品制备方案。结果显示，冷冻过程导致受损细胞的比例升高，但并不影响其单细胞的转录表达谱。

图1. 比较分析来自新鲜（红色）和冷冻保存（-80℃：蓝色；液氮：绿色）HEK293细胞的MARS-Seq单细胞转录组数据。

图2. 来自新鲜（红色）和冷冻保存（蓝色）HEK293细胞的MARS-Seq单细胞转录组的相关性鉴定细胞亚群。

研究人员拓展使用Smart-seq2方法，分别为48个新鲜和47个冷冻保存（-80℃）的HEK293和K562细胞构建了Smart-seq2文库。结果类似。

图3. 来自新鲜（红色）和冷冻保存（蓝色）HEK293细胞的Smart-seq2单细胞转录组的比较分析。

图4. 来自新鲜（红色）和冷冻保存（蓝色）K562细胞的Smart-seq2单细胞转录组比较分析。

前期实验表明冻存的培养细胞可用于单细胞分析，对更复杂的实验设计具有适用性。研究人员又进一步将应用范围扩大到复杂的原代组织。他们对新鲜和低温保存的人外周血单核细胞（PBMC）、小鼠结肠组织进行MARS-Seq实验，最后将其扩展到人类肿瘤样本。结果同样是冻存后受损细胞增加，但转录模式或基因表达水平方面没有差异。

图5. 来自新鲜（红色）和冷冻保存（蓝色）PBMC细胞亚型的单细胞转录组数据相关性分析。

图6. 来自新鲜（红色）和冷冻保存（蓝色）小鼠结肠细胞的单细胞转录组数据。

图7. 来自新鲜（红色）和冷冻（蓝色）病源原位卵巢肿瘤异种移植细胞的单细胞转录组数据的比较分析。

>>> 结论

本文研究人员提出的冻存过程不会改变从细胞培养物或组织分离出的单细胞转录图谱。通过此方法冷冻保存的细胞，和新鲜细胞一样能够提取相关的生物信息，如细胞类型特异性程序。这大大拓宽了单细胞转录组学应用的范围，并且可能引起单细胞研究设计的范式转变。

参考文献

Guillaumet-Adkins et al. Single-cell transcriptome conservation in cryopreserved cells and tissues. Genome Biol. 2017, 18: 45.