Hello，今天Dr. cell给大家介绍一些单细胞领域中新的东西，它能帮助大家获得更加详细的细胞表型，而不只是局限于单细胞转录组的转录本信息上。
众所周知，10X Genomics公司的大规模scRNA-seq受到研究者们的极大关注，这是解释复杂细胞群体的重要方法。但对于一些额外的表型信息，如细胞表面蛋白marker，却无法提供。
为了解决这一问题，10x公司于2019年初更新了单细胞测序的试剂盒，将细胞表面蛋白测序所需要的引物纳入现有的试剂盒中，称之为Total-seq。今天，我们就来解锁一下Total-seq的前世今生。
文章很长，但慢慢品读，你会发现新大陆“一个叫cell-hashing新实验，听说它能大大减小你的单细胞测序成本哦”。
难点：高通量单细胞转录组测序，如何能获得更加详细的细胞表型特征？
目前scRNA-seq其无偏和高通量的特性，对于描述细胞类群的异质性是非常有好用的工具。在使用单细胞基因组学之前，对细胞状态的定义，只能依靠精心设计的与细胞表面蛋白直接结合的荧光标记抗体来实现，这些抗体通常是细胞活性或功能的可靠指标。
最近的研究已经将索引归类的方法与单细胞转录组学相结合，从而能够将免疫表型与转录组学得到的细胞簇相匹配。然而，基于微流控、微孔或组合索引的大规模测序的方法，并没有利用流式细胞仪将细胞分离，因而不能将蛋白信息和转录组数据相匹配，这也成为此类方法的一个限制。
利用靶向的方法同时测得单细胞的转录本和蛋白质信息，又受到规模的限制，只能同时进行一部分基因和蛋白的测定。
一种新的方法：同时测定细胞表面蛋白和转录图谱
本研究中，我们发明了一种细胞索引转录组和抗原决定簇测序的方法（CITE-seq），能够将多种基于抗体检测的蛋白标记物及数千个细胞的无偏差转录图谱同时测定。研究发现，这种方法可以同时适用于两种不同的高通量单细胞测序，并通过实例显示出，该方法比单独的单细胞测序数据能够得到更加详细的细胞表型特征。
CITE-seq：我们是如何做的？
基于与抗体结合的寡核苷酸序列，能够通过测序的得到的序列数而被测定，并以此作为蛋白质的丰度这一假设，我们将抗体与寡核苷酸结合，进行了如下设计：
1）能够被基于寡聚dT建库的RNA文库所捕获；
2）含有用于区分抗体条形码序列；
3）能够进行后续的PCR特异扩增。
Fig 1a Illustration of the DNA-barcoded antibodies used in CITE-seq
我们使用常用的链霉素-生物素亲和反应将抗体与寡核苷酸的5’端连接起来，同时还包含了一个二硫键，于是在还原条件下寡核苷酸便能够从抗体上释放出来。
首先，将抗体-寡核苷酸复合体于单细胞悬液孵育，孵育条件与用流式细胞仪的染色步骤类似。
之后，洗涤这些细胞，以去除那些未能结合的抗体；样本即可用于做scRNA-seq。
Fig 1b Schematic representation of CITE-seq in combination with Drop-seq
本研究中，我们使用用于Drop-seq及10X Genomics的微流控仪器，将细胞包裹在纳米级的水滴中（Fig 1b）。之后，细胞在水滴中裂解，mRNA和与抗体结合的寡核苷酸通过它们3’端的polyA尾巴，同时与含有polyT的微珠发生退火而结合在一起。在反转录时，与微珠结合的一段特殊的条形码序列能够区分来自于不同细胞的mRNA和与抗体结合的寡核苷酸序列。而扩增了的来源于抗体的序列（ADTs）和cDNA分子能够通过大小区分开，并将其构建为独立的Illumina测序文库（Fig1 b）。
需要注意的是，两个文库类型是可以同时进行测序的，但考虑到测序深度问题，由于它们是单独构建的，因此可以将它们合并在单一泳道中并调整它们的相对比例，以确保每个文库都能获得适当的测序深度。
Fig 1c-e CITE-seq分析人和小鼠细胞混合物
用CITE-seq区分表面蛋白的表达量实验，将人、小鼠细胞混合物与人、小鼠特异的CD29抗体一起孵育，清洗后进行10x scRNA-seq。结果见fig 1c-e。在大细胞量（droplet比例也会较高）的情况下，基于scRNA-seq与表面蛋白的分类结果，及得到的细胞数量一致性较高，表明表面蛋白序列较少出现信号丢失的情况。
CTTE-seq较好的细胞定量能力：与流式细胞仪结果比较，一致性高
为了鉴定CITE-seq进行细胞定量的能力，将CITE-seq的ADT蛋白序列与作为表面蛋白定量金标准的流式细胞仪结果进行比较。将同样的抗体对同一份外周血细胞同时进行多重荧光流式细胞分选和CITE-seq实验。基于表面蛋白表达量的细胞分布图见fig 2a-b。图中T细胞、B细胞、浆细胞、髓样树突细胞和单核细胞的细胞分布，两种方法得到的结果一致性高。
为了比较了流式细胞仪和CITE-seq在基因表达定量方面的差异，将脐血单核细胞与CITE-seq和流式细胞仪需要的CD8a抗体进行孵育结合，分别进行CITE-seq和流式分选。通过细胞分选，根据CD8a荧光的强弱，将细胞分为CD8a极强（+++），CD8a强（++），CD8a中（+），CD8a弱（+/-）。并将不同部分的细胞再做流式和CITE-seq，每一部分的细胞，流式和CITE-seq都得到了类似的结果，且CD8a的表达水平相当。
因此，利用CITE-seq得到ADTs序列，不仅能够将免疫分型和转录组学结合起来，而且其定量结果与被称为金标准的流式细胞分选的结果一致性高。
Fig 2. CITE-seq与流式细胞仪的定性、定量结果比较
CITE-seq：挑战免疫细胞，能更清晰的鉴别细胞类型
接下来，我们又用CITE-seq测试了免疫细胞，这一复杂的细胞群体，鉴定其多种的免疫表型和转录组学特征。免疫细胞具有多种细胞表面蛋白，不同类型的细胞也具有不同scRNA-seq表达谱。通过两种方法（细胞表面蛋白标记和单细胞RNA图谱）鉴定细胞类别，得到相同的结果（Fig 3b）。
我们发现，同一基因的ADT水平要高于其相应的mRNA水平，因而也就不太容易出现信号丢失的情况（Fig 3c）。此外，基于ADT对细胞进行分类，可以作为基于转录组的细胞分类的一种补充，得到更加清晰明确的细胞类群。
那么，与单独的scRNA-seq相比较，CITE-seq能够提高免疫细胞表型的鉴别吗？
我们注意到，在由转录数据分类得到的NK细胞中，CD56和CD16在ADT水平上表现出相反的趋势，即存在CD56高和CD56低这样的亚群（fig 3b），因而可以根据CD56的ADT水平将NK细胞继续分亚群。与文献结果类似，这一类群的细胞中，蛋白和RNA的变化具有很高的一致性。我们发现与CD56的ADT相比，CD16的ADT水平可以作为两个亚群间一个很好的补充分类特征，从而也在一定程度上减少了CD8a ADT的依赖。在已报到的11个可以分类的标记基因中，有10个基因的表达趋势都与文献一致。这展示了CITE-seq通过整合和多模型分析从而提高细胞免息分型方面巨大的潜力，尤其是在细胞类群和转录组数据有些微不同时。
Fig 3. CITE-seq能够同时测定脐血单核细胞的多个特征
CITE-seq：单细胞测序中不容忽视的一个进步
在获得scRNA-seq数据的同时，能够同时得到其他分子定量信息，是单细胞测序技术发展史上一个令人兴奋的进步，并不断迎接新的挑战。
优点
1. CITE-seq第一次使基于液滴的单细胞测序技术能够进行多维度的分析：帮助发掘scRNA-seq不能发现的新的细胞类型。
2. 与流式细胞相比，CITE-seq又可以不受抗体之间信号干扰的影响，大大增加了表面蛋白标记的数量，从而可以一次性获得多种由抗体蛋白指示的免疫表型的信息。甚至，如果关注点在细胞蛋白上，ADTs可以独立于细胞的mRNA而单独测序、分析，即已报到的Abseq。
3.CITE-seq能够与商业化的单细胞测序仪（10X Genomics）无缝衔接，并不需要过多其他的个性化设计。方便易操作。
CITE-seq后续发展如何呢？还有哪些新的应用呢？Total-seq又是怎么运作的呢？敬请期待下回分解……
另外，你知道吗？Total-seq还有一个新应用，即可以将不同的样本做上标记，作为一个样本进行scRNA-seq，既节约了费用，又做了多个样本的scRNA-seq，方便后续试验分析。这么高大上的试验，叫做Cell-hashing。有没有迫不及待要开始一段单细胞表面蛋白的新试验之旅了呢？欢迎咨询dafabet手机黄金版当地销售~
参考文献：
1. Stoeckius M, Hafemeister C, Stephenson W, et al. Large-scale simultaneous measurement of epitopes and transcriptomes in single cells[J]. Nature methods, 2017, 14(9): 865.
2. Shahi P, Kim SC, Haliburton JR, Gartner ZJ, Abate AR. Abseq: Ultrahigh-throughput single cell protein profiling with droplet microfluidic barcoding. Scientific Reports. 2017; 7:44447. [PubMed: 28290550]
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扎实的技术基础→合适的平台选择→明确的研究方向→历经考验的实验技能→深入的生信挖掘→单细胞测序后的功能验证实验
