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全方位解读，10x Gemomics单细胞ATAC-seq技术
发布日期：2019-09-09浏览： 次
近几年，ATAC-seq的研究非常火，10x Genomics公司也适时跟进，于18年底推出了首款商业化的单细胞表观遗传的研究方法：10x单细胞ATAC-seq。
 
可能很多老师都听过这项技术，但却不知道它具体怎么应用。
 
对于单细胞转录组测序，其主要结果“细胞聚类”、“差异基因分析”比较容易理解和应用。而表观遗传学，大家普遍接触较少，对染色质、表观调控等方向的研究都不是特别熟悉。
 
今天小编就给大家详细介绍一下单细胞ATAC-seq技术，以便从表观调控层面进行单细胞研究，作为单细胞转录组的补充，挖掘更深层的分子机制。
 
 
图1
 
一、ATAC-seq是什么？
 
ATAC-seq（Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing），即利用转座酶研究染色质可进入性的高通量测序技术。从定义可以看出该技术的研究目标是染色质的可进入性。
 
我们都知道DNA链很长，要压缩在很小的细胞核中，必须形成紧密的高级结构。但连接过于致密的话，调控蛋白就无法进入染色质启动基因的转录。所以要启动基因的转录，就需要打开染色质的高级结构，游离出部分DNA使调控蛋白（比如转录因子和转录元件）与之相结合，这种特性就叫做染色质的可进入性（chromatin accessibility）。据此，我们可以知道染色质开放区域主要研究的是转录因子的结合及其对基因表达的调控。
 
那么ATAC技术是如何获得染色质开放区信息的呢？
 
主要依据的是Tn5转座酶，一种随机切割DNA的酶。其原理是核小体连接致密的地方，转座酶不能进入，而染色质开放的区域，转座酶能够进入并切割暴露的DNA，同时连接上特异性的序列（见下图）。所以只要将携带已知DNA序列标签的转座酶加入到细胞核中，再利用已知序列的标签进行PCR后测序，就可获得基因组染色质开放程度的信息。
 
 
图2
 
二、10x Genomics单细胞ATAC-seq
 
随着单细胞测序技术的发展，单细胞ATAC-seq的研究也逐渐热起来，从2018年开始单细胞ATAC研究的文献逐步增加。
 
那么跟bulk水平的ATAC比，单细胞ATAC有哪些优势呢？
 
首先，解决了细胞异质性的问题，可以发现稀有且重要的细胞亚群。
其次，可以挖掘细胞分化过程的关键调控因子。
最后，可以揭示疾病发生的表观调控机制。
 
鉴于单细胞ATAC研究的优势，10x Genomics推出了单细胞表观遗传学解决方案：Chromium Single Cell ATAC Solution。
 
其技术原理跟10x单细胞转录组类似，利用双十字微流控系统分离单细胞核，然后通过Gel Beads 上的barcode标记转座酶切割的DNA。
 
简要实验流程如下：
 
首先，将转座酶加入制备好的单细胞核悬液进行反应。
随后，利用8通道的微流体双十字交叉系统将含Barcode的Gel Beads、细胞核和酶的混合物、油三者结合形成GEMs。在GEMs中，凝胶珠溶解释放大量barcode序列，DNA延伸带上barcode序列，并进行线性扩增。
最后，进行illumina的文库构建。
 
 
图3
 
依托于相同的技术原理和系统，10x单细胞ATAC-seq包含单细胞转录组优势的同时，也存在独特优势：
 
1. 高通量的细胞捕获，适用于细胞系、原代细胞、新鲜组织和冻存样本的研究；
2. 线粒体DNA的比例很低；运用10x官方软件和工具，可对单细胞基因调控网络进行精细化分析；
3. 相较于其他单细胞核捕获平台，价格大幅降低。
 
基于这些优势，10x单细胞ATAC-seq可以有哪些方向的应用呢？
 
从具体分析内容来讲，单细胞ATAT测序：
 
●  可在单细胞水平揭示细胞核内染色质可接近性的差异；
●  可鉴定细胞类型特异的转录因子，深入研究转录调控网络；
●  可预测转录因子结合位点，推测染色质调控活性。
 
从生物学研究大方向分，单细胞ATAC测序：
 
●  可应用于干细胞或发育生物学的研究，绘制驱动细胞分化的调控网络；
●  适用于免疫学研究，可揭示T细胞激活、分化等过程的表观调控机制；
●  可挖掘用于肿瘤亚型鉴定的新型分子标记，研究肿瘤发生相关的重要通路；
●  可应用于神经科学，鉴定复杂的神经细胞亚型，探究神经相关疾病的分子机制。
 
三、dafabet手机黄金版10x单细胞ATAC-seq服务
 
作为最早引进10x单细胞ATAC-seq服务的公司之一，我们可以提供全方位的单细胞ATAC-seq服务，包括样本的制备，文库的构建，二代测序，测序后的数据分析。
 
目前已经积累了丰富的项目经验，做过人、大鼠、小鼠、猴子、玉米等多个物种的项目，所有类型的样本均已涉及，如细胞系、新鲜组织、原代细胞及冻存细胞等。
 
细胞核制备是ATAC-seq实验中的难点，依据我们的项目经验，可以为客户提供多类型样本的上门细胞核制备服务。
 
针对客户提供的样本要求如下：
 
●  样本类型：细胞系，原代细胞，冻存细胞，新鲜组织等
●  细胞来源：血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等
●  样本量：细胞>1x105 cells/sample；组织约黄豆粒大小
●  细胞活率：大于80%，越高越好
 
如有其他特殊样本处理需求或问题可以联系相关技术人员。
 
因为我们是带着10x仪器上门服务的，所以制备完细胞核悬液之后，可立即进行文库的构建，保证细胞损失最少。
 
此外，我们还提供配套的数据分析服务。数据分析内容我们分析团队近期已经进行了升级，可以提供更丰富的分析结果，且可提供与单细胞转录组的整合分析内容。我们会持续更新数据分析的内容，也欢迎各位老师提出更多的个性化需求，我们共同成长和进步。
 
部分示例结果如下：
  
 
图4  细胞聚类T-SNE和基因启动子区peak可视化
 
 
图5 不同类型细胞的差异peak 功能富集分析
 
 
 
图6  单细胞转录组与ATAC整合聚类分析
 
dafabet手机黄金版提供10x Genomics单细胞测序完整解决方案
 
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