扎实的技术基础→合适的平台选择→明确的研究方向→历经考验的实验技能→深入的生信挖掘→……过关斩将、步步为营，单细胞研究甚是艰辛。但这不是终点。
近期，Dr.cell发现随着时间的推移，单细胞测序在高分文章中的成分比例有逐渐减少的趋势，这要求科研工作者将更多的精力放在单细胞测序后功能验证实验上。
作为近几年兴起的较火的研究技术，从各领域的单细胞文献中就能发现，研究套路基本一致。
研究主题主要有：
1. 寻找marker基因；
2. 新群鉴定；
3. 追踪亚群之间的演化关系。
常见分析内容主要有：
1. tnse降维分析鉴定细胞群；
2. 差异基因分析鉴定marker基因；
3. 拟时轨迹分析亚群之间的演化关系；
4. marker基因的各种展示，包括热图、小提琴图、散点图等；
5. marker基因的生物学通路和功能分析。
图1 文献常见10X单细胞套路总结
同时，不难发现，备受CNS期刊青睐的单细胞测序文章中，前沿的研究者会不仅通过先进的单细胞平台“寻找marker基因”或“新群鉴定”，而是将研究更进一步，通过后续功能验证实验，呈现出更完整的研究思路。
这里，通过10x单细胞相关文献，我们整理出了单细胞测序后续功能验证常见套路，根据难易程度进行排序我们总结如下：（仔细阅读，不然你会遗漏关键点 ）
1. RNA fish试验
这个是文章中最常见的验证实验，也是推荐的最基础最重要的实验，适合10X单细胞测序均在RNA水平上的验证，验证成功率最高，也是我们推荐必须要做的保底性质的验证实验。Fish实验不仅可以验证10X的marker基因结果，同时可以观察到marker基因对应的细胞群在组织中的空间定位。
需要注意：10X平台测序数据一般是3端 或者5端的98bp，所以在设计fish探针的时候根据自己的数据（3端还是5端），设计探针的位置尽量和自己数据的位置接近。
2. 免疫荧光实验
蛋白水平的验证实验，同RNA fish验证实验一样可以对10X的marker基因结果验证，也可以进行观察marker基因对应的细胞群在组织中的空间定位，不仅如此还能观察蛋白在细胞内的定位，根据不同的细胞器定位进行后续的功能研究提供线索。
需要注意的是免疫荧光实验也有两个常见的坑：
1.可能需要购买多家公司的抗体进行验证实验；
2.由于细胞内表达RNA和蛋白的翻译不是绝对的线性相关，因此RNA水平和蛋白水平可能不一致，最典型的是CD34（T细胞marker），CD34在蛋白水平上是T细胞不错的marker，但是在单细胞数据中仅仅能覆盖大概40-60%的T细胞。
3. 单细胞SMART-qPCR
这个验证实验也是我们推荐的一个验证实验，同10X单细胞一样均是RNA水平的验证，验证率高。
难点：
1.分离感兴趣细胞群的单个细胞；
2.需要进行SMART扩增，成本上较高。
4. 单细胞数据的转录调控机制（SCENIC分析转录因子调控网络）的验证，bulk ATAC-seq
这个验证实验是针对做转录调控机制进行准备的，由于采用的是bulk ATAC-seq验证，因此验证的是所有群共同的调控机制。如果是想验证某特定细胞群的调控机制，需要进行感兴趣细胞群的分选，对分选后的细胞进行bulk ATAC-seq。
5. 特定细胞群的分选
如果能挑选出合适的膜表面marker，可以直接进行流式分选或者磁珠分选。
如果挑选的是胞内marker，需要荧光报告小鼠对marker蛋白进行荧光标记，之后才能进行后续敢兴趣marker基因对应的细胞群分选。这个实验主要是验证新细胞群，当时也可以进行后续的SMART-qPCR和bulk ATAC-seq验证。
6. 谱系示踪技术证明群的演化关系
谱系示踪是最近发育分化研究中比较火的技术，这个技术的关键是挑选合适的marker基因，而单细胞测序刚好是选择marker基因神技术。10X单细胞测序和谱系示踪小鼠可以进行完美搭配。
7. 感兴趣细胞群的marker基因或者富集出的信号通路的功能验证
难度系数最高的10X单细胞验证实验。根据我们的经验10X单细胞测序平均能覆盖的基因大概700-2000个，因此很容易漏掉生物学功能的主效基因，因此挑选marker基因进行功能实验风险还是比较大的，但是也有高分文章进行功能实验验证。另外如果marker基因的功能验证难度较大也可以放宽条件，对marker基因富集出的信号通路进行功能验证
典型文献，一一举证，更立体的理解！
1. RNA FISH试验
2018年science文章Molecular, spatial and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region利用单细胞测序找到marker基因，之后将这些marker基因设计成探针进行大脑的组织原位杂交观察不同神经元和非神经元亚群之间的空间定位。
图2 组织原位FISH展示神经元组织空间定位
2. 免疫荧光实验
2018年cell文章“Toward Minimal Residual Disease-Directed Therapy in Melanoma”一张MITF蛋白的免疫荧光结果即是文章的证据也是整篇文章思路的源泉。作者从MITF在组织中的异质性表达整理出来了整篇单细胞文章的思路，揭示出了黑色素瘤微小残留耐药的重要原因。
图3 2018年cell 黑色素瘤MITF免疫荧光结果
3. 单细胞SMART-qPCR
2018年cell文章“A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Aging Drosophila Brain”通过Gal4品系的果蝇表达GFP：R23E10-Gal4示踪果蝇(文献中已经报道的dFB类细胞)分选出dFB类细胞细胞通过CEL-seq(22 cells)、smart-seq2(45 cells、34 cells)进行单细胞qPCR。
图4 2018年cell单细胞qPCR验证
4. 单细胞数据的转录调控机制（SCENIC分析转录因子调控网络）的验证
2018年cell文章“A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Aging Drosophila Brain”通过SCENIC分析出了调控果蝇大脑发育的150个转录因子，其中onecut参与了所以细胞群的共同调控，作者用bulk ATAC-seq进行了验证。
图5 2018年cell的bulk ATAC-seq验证
5. 特定细胞群的分选
2018年上Cell Reports文章“Single-Cell Transcriptional Profiling Reveals Cellular Diversity and Intercommunication in the Mouse Heart”利用单细胞测序鉴定出了心壁细胞，成纤维细胞和施旺细胞的marker基因，利用marker基因Cspg4和Pgdfrb做成荧光报告基因小鼠分选出了纯度更高的心壁细胞，成纤维细胞施旺细胞。
图6 2018年Cell Reports利用marker基因进行细胞群分选
6. 谱系示踪技术证明群的演化关系
2014年cell文章“Identification and Specification of the Mouse Skeletal Stem Cell”利用谱系示踪小鼠追踪到了骨骼发育的小鼠骨骼干细胞。2018年cell文章“Identification of the Human Skeletal Stem Cell”利用单细胞测序和谱系示踪技术配合鉴定出了人的骨骼干细胞。由于常规谱系示踪只能同时标记一两个marker基因，限制了多谱系分化示踪的应用。2019年的nature文章“Molecular recording of mammalian embryogenesis”利用crispr-cas9和单细胞测序技术开发了基于条形码的谱系示踪技术，扩展了常规谱系示踪技术的应用。
图7 2014年cell谱系示踪技术追踪小鼠骨骼单细胞
图8 2018年cell单细胞测序配合谱系示踪追踪人类骨骼干细胞
图9 2019年nature条形码谱系示踪技术
7. 感兴趣细胞群的marker基因或者富集出的信号通路的功能验证
发表在2017年nature杂志上文章“Non-equivalence of Wnt and R-spondin ligands during Lgr5+ intestinal stem-cell self-renewal”对Lgr5+ ISCs不同干细胞亚群对应的两个信号通路Wnt和RSPO信号通路进行了验证。
图10 marker基因的功能验证实验
总结：
研究人员可根据自己的单细胞数据整理出来的文章脉络选择性的进行验证实验。
• 推荐需要做的保底性质的验证实验两个：RNA FISH实验和单细胞SMART-qPCR。
• 加分性质的验证实验两个：单细胞数据的转录调控机制（SCENIC分析转录因子调控网络）的验证和特定细胞群的分选（marker基因的荧光报告小鼠）。
• 周期较长难度较大的挑战性质的验证实验两个：marker基因或者信号通路的功能验证实验和谱系示踪小鼠实验（针对发育分化或者肿瘤克隆进化）。
各位老师可以在自己的科研需求中选择合适自己的验证策略。
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参考文献：
[1] Moffitt J R , Bambah-Mukku D , Eichhorn S W , et al. Molecular, spatial and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region[J]. Science, 2018.
[2] Florian R , Aljosja R , Oskar M B , et al. Toward Minimal Residual Disease-Directed Therapy in Melanoma[J]. Cell, 2018:S0092867418307931-.
[3] Kristofer D , Jasper J , Duygu K , et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Aging Drosophila Brain[J]. Cell, 2018:S0092867418307207-.
[4] Skelly D A, Squiers G T, Mclellan M A, et al. Single-Cell Transcriptional Profiling Reveals Cellular Diversity and Intercommunication in the Mouse Heart[J]. Cell Reports, 2018, 22(3):600.
[5] Chan C F , Seo E , Chen J , et al. Identification and Specification of the Mouse Skeletal Stem Cell[J]. Cell, 2015, 160(1-2):285-298.
[6] Chan CKF, Gulati GS, Sinha R, et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 2018;175(1):43-56.e21
[7] Chan MM, Smith ZD, Grosswendt S, et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 2019;570(7759):77-82
[8] Yan K S , Janda C Y , Chang J , et al. Non-equivalence of Wnt and R-spondin ligands during Lgr5+ intestinal stem-cell self-renewal[J]. Nature, 2017.
