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​hello，大家好。我是细胞博士。我有一个很洋气的名字Dr. cell。经过多年的摸爬滚打、潜心钻研，我终于学成归来。很高兴在这个庄严、隆重的场合闪亮登场。

多年图书馆沉浸式学习、实验室不分日夜的操作实践、生信分析代码的鏖战，我最最最富有的就是学习笔记、研究经验。对于“单细胞研究”，我很自信。

当然，我是一个“大肚”的人，未来我会慢慢将我“单细胞研究”学习笔记传授给大家。

第一次跟大家见面，我肯定不会空手而来。对细胞“博古通今”的我，先带来一个重磅：单细胞研究最热门的方向——单细胞转录组测序。看完下面我的笔记，我相信你肯定会对单细胞转录组测序的技术路线有一个成熟的把握。

单细胞研究您该知道的事~

人们对细胞的认识可以从1665年Robert Hooke发现细胞说起，科学家们对植物细胞和动物细胞展开了进一步的观察研究，并由Schleiden和Schwann最早创立细胞学说，直到19世纪中期该学说才得以完善。从这些研究结论中我们认知到细胞是生物体结构和功能的基本单位，每个细胞有独特的表型和生物学功能，细胞之间存在异质性，这也正是细胞作为生命科学研究的最基本单位的意义所在。

相同或不同组织、器官、系统中的细胞均存在异质性，这不仅体现在形态结构上，由于细胞的命运由遗传物质决定，其本质差异更体现在基因组、转录组、表观组等层面，因此可对不同组学展开单细胞研究，其优势在于能够避免Bulk样本的均质化掩盖单细胞的异质性，可以在单细胞水平深入探索健康生理和疾病异常下的细胞状态，以了解生物体的功能机制和发现更为有效的疾病治疗方法。

近几十年来，人们一直围绕单细胞进行研究，2013年，单细胞DNA测序和单细胞RNA测序曾被Nature Methods评为年度技术；2016年，大型国际合作项目“人类细胞图谱计划”（The Human Cell Atlas）启动，该项目根据独特的分子信息（如基因表达）对所有人类细胞种类进行定义，并将这些信息与传统的细胞学表述（如位置和形态）相关联，在全球掀起了单细胞研究的热潮，尤其单细胞转录组测序是目前单细胞研究最热门的方向。

 单细胞转录组测序

最早的单细胞组转录组技术只能检测单个细胞中的少数基因，细胞和基因的通量都比较低^[1]，后来通过结合芯片技术使细胞和基因的通量有所提升^[2,3]，直到2009年汤富酬^[4]将单细胞转录组与高通量测序结合时，基因检测通量才大大提升，比芯片能检测更多的转录本，这也是单细胞转录组测序的雏形，在此基础上细胞分离技术和检测技术等不断得到提升改进，逐渐发展出现今比较成熟的技术。

单细胞转录组测序的技术路线大致为：

单细胞转录组研究面临的一大技术难题是如何提升细胞通量，关键的技术突破是需要实现自动分离单细胞、从单个细胞中非定向扩增整个转录组、提升并行处理多个细胞的能力。从最初的人工手动分离如显微吸取法、激光显微切割法等，发展到自动化的集成流体电路、液滴微流控技术等，细胞通量从个位数跳跃到数万个细胞的数量级。分离得到的单细胞需要进一步保证拥有各自独立的微反应体系，比如微孔板利用孔间隔离、液滴微流控利用油滴包裹单细胞隔离。

细胞标记是利用十多个碱基的核苷酸序列作为标签（Barcode），在单细胞微反应体系的逆转录过程中进行标记，同一个细胞内的所有转录本标记上相同的Barcode，这样在后续建库时能够混合操作，在数据分析层面也能够达到区分单细胞表达谱数据的目的，如STRT-seq^[5]、CEL-seq^[6]等。随着技术的升级，后来又引入了单细胞转录本UMI（Unique Molecular Identifier）标记，以解决PCR Bias对基因表达定量的影响，使基因定量更加精确，如CEL-seq2^[7]、Drop-seq^[8]。逆转录-标记之后得到cDNA链，进一步基于PCR或IVT技术对cDNA扩增以达到二代测序的要求。

对于检测的基因类型，目前单细胞转录组测序是通过Poly（dT）捕获携带Poly（A）的RNA分子，主要检测mRNA和很少部分的lncRNA，检测的基因区域范围一般是3’ 端50-100 bp左右，对中高表达的基因较为敏感。与Smart-seq2相比，Smart-seq2虽然能够检测mRNA的全长信息、较多的基因数目，但是细胞通量低、成本较高，不适合大规模的单细胞研究。Smart-seq2与STRT-seq、CEL-seq、Drop-seq等技术相比能够检测mRNA的全长信息，获得较多的基因数目，但该技术仍存在细胞通量低、成本较高的缺点，不适合大规模的单细胞研究。

高通量单细胞转录组测序在数据分析上有一定的套路可循：

• 根据基因表达特征划分细胞群
• 寻找细胞群之间的差异表达基因
• 差异表达基因的功能富集分析
• 通过marker gene鉴定细胞类型
• 过拟时轨迹分析细胞之间的变化

当然，除此基本的分析套路之外还可以展开其他更为高级、个性的数据分析。 

综上，在众多研究者们的共同努力下，人们逐渐意识到研究单细胞的价值所在，形成了越发成熟的技术路线：从细胞分离→细胞标记→基因检测→数据分析。

参考文献

[1] Lambolez, B. et al. Neuron 9, 247–258 (1992). PMID: 1323310

[2] Tietjen, I. et al. Neuron 38, 161–175 (2003).

[3] Kurimoto, K. et al. Nucleic Acids Res. 34, e42 (2006).

[4] Tang, F. et al. Nat. Methods 6, 377–382 (2009).

[5] Islam S. et al. Genome Res. 2011 Jul;21(7):1160-7.

[6] Hashimshony T. et al. Cell Rep. 2012 Sep 27;2(3):666-73.

[7] Hashimshony T. et al. Genome Biol. 2016 Apr 28;17:77. 

[8] Evan Z. et al. Cell. 2015 May 21;161(5):1202-1214.

我的笔记还算详细吧。单细胞转录组测序的路线熟悉了吗？欢迎大家读完后与我探讨。