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本文以“Berberine ameliorates blockade of autophagic flux in the liver by regulating cholesterol metabolism and inhibiting COX2-prostaglandin synthesis”为题，2018年8月发表于杂志《Cell Death & Disease  》。其中，转录组测序部分在dafabet手机黄金版完成。

过量胆固醇会导致心血管疾病的发生。黄连素（BBR）被报道可调节胆固醇平衡。本文作者发现BBR可改善胆固醇超载导致的肝脏自噬流阻滞，其潜在机制包括降低肝脏胆固醇水平，通过减少固醇载体蛋白2的表达来调节胆固醇在膜上的分布，抑制环氧酶2介导的前列腺素代谢物的生成。

作者研究显示BBR可作为一种药物通过调节自噬流来保护胆固醇超载的肝脏。

研究背景

 胆固醇超载会导致代谢紊乱，比如心血管疾病，已成为世界上发病率和死亡率最高的疾病之一。肝脏中过量胆固醇积累会导致强烈的脂毒性，比如内质网（ER）压力，溶酶体损伤，线粒体功能破坏，进一步加剧代谢紊乱。研究显示自噬参与脂质平衡，损伤自噬流可导致过量脂肪累积，严重的肝脏氧化压力和炎症。

研究结果

1、黄连素可增加胆固醇超载肝脏中的自噬流

高脂饮食（AD）和高胆固醇饮食（HCD）会导致老鼠肝脏胆固醇的积累。BBR可降低游离胆固醇（FC）和胆固醇酯的累积（ Fig. 1a）。依替米贝(Ezetimibe)治疗与BBR疗效相似（Fig. 1b）。对老鼠肝脏进行HE染色显示由于脂滴的累积导致肝细胞膨胀 (Fig. 1c)。作者检测两个自噬蛋白标志物-p62,LC3的表达，发现p62（自噬流阻滞指示物）在高脂和高胆固醇饮食的小鼠肝脏中累积(Fig. 1d,1f)。BBR处理后明显降低p62蛋白水平，增加LC3B蛋白水平(Fig. 1d)。依替米贝(Ezetimibe)治疗与BBR疗效相似（Fig. 1e）。

图1 BBR对肝脏胆固醇积聚和自噬通量阻断的影响。

2、黄连素直接调控肝脏细胞的自噬流

电子显微镜下观察发现，胆固醇处理可增加黄点的数量，黄点是自噬体与溶酶体融合受损伤的信号 (Fig. 2a)。使用氯喹（CQ，用于阻滞自噬流的溶酶体抑制剂）处理肝癌细胞系，与上述胆固醇处理结果相同。BBR处理后，黄点数量减少，说明BBR能促进自噬体与溶酶体融合。另外，使用胆固醇或CQ处理后增加P62和LC3B的蛋白水平(Fig. 2b)，相反，BBR处理减少二者的水平（Fig. 2c，d, e）。

图2 BBR处理对HepG2细胞中胆固醇诱导的自噬通量阻断的影响。

3、黄连素调节参与胆固醇代谢的关键蛋白

胆固醇主要分布在细胞膜和细胞器上，比如内质网。菲律宾菌素可选择性结合游离胆固醇，用于检测肝细胞中胆固醇的分布。作者在电子显微镜下观察到菲律宾菌素信号在细胞膜上是明显的，但在细胞内是微弱和弥散的。BBR处理后会明显减弱膜上的菲律宾菌素信号，增加在细胞器上的信号。以上数据显示BBR会导致细胞内游离胆固醇的再分布(Fig. 3a)。

参与细胞内胆固醇运输的蛋白- SCP2，STARD4在BBR处理肝癌细胞系后表达下调(Fig. 3b，c)， 在老鼠高脂饮食中加入BBR后同样导致SCP2和STARD4的下调(Fig. 3d)。胆固醇变成胆汁酸是去除过量胆固醇的关键途径，而CYP7A1是该过程的速率限制酶，而作者发现BBR处理后可以提高CYP7A1的表达(Fig. 3b, c, d)。

图3 BBR处理肝细胞中的胆固醇分布和转运蛋白表达。

4、黄连素通过抑制AKT/mTOR的磷酸化激活自噬

 AKT/mTOR是调控自噬的重要通路，胆固醇超载会导致AKT/mTOR磷酸化的激活 (Fig. 4a, d)。BBR处理可抑制AKT/mTOR磷酸化(Fig. 4b),并能逆转胆固醇导致的AKT/mTOR磷酸化激活(Fig. 4a, c),而ERK或AMPK磷酸化没有改变。

图4 BBR对AKT和mTOR磷酸化的影响。

5、黄连素通过抑制PGE2的合成调节自噬流

 RNA测序显示，BBR处理后，花生四烯酸代谢通路被显著富集(Fig. 5a)。在AD累积组参与花生四烯酸代谢的关键基因表达水平显著增加，BBR处理后下降(Fig. 5b)。COX2的mRNA和蛋白水平在AD处理组表达增加，在BBR处理组表达下降 (Fig. 5b, c，d, e)。

图5 BBR对肝COX2 /前列腺素代谢的调节。

在胆固醇超载的细胞中，自噬流阻滞伴随着COX2表达的增加。COX2抑制剂处理后，可降低COX2的表达，改善胆固醇诱导的自噬流阻滞(Fig. 6a,b,c)。COX2过表达可明显增加AKT和mTOR的磷酸化水平，导致自噬流阻滞。BBR通过抑制COX2蛋白表达和AKT/mTOR磷酸化可部分改善自噬流阻滞（Fig. 6d）。

   PGE2是前列腺素新陈代谢通路中的代谢物，对胆固醇累积诱导的肝炎起作用。自噬流可被PGE2阻滞，而BBR可恢复被PGE2阻滞的自噬流。作者还发现PGE2可激活AKT磷酸化，BBR抑制该过程(Fig. 6e)。

图6在BBR处理的HepG2细胞中COX2表达和自噬通量。

图7 BBR的机制示意图改善胆固醇超负荷引起的自噬通量的阻断。

参考文献

Sun H, Liu Q, Hu H, et al. Berberine ameliorates blockade of autophagic flux in the liver by regulating cholesterol metabolism and inhibiting COX2-prostaglandin synthesis[J]. Cell death & disease, 2018, 9(8): 824.