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本文以“α-Ketoglutarate Promotes Pancreatic Progenitor-Like Cell Proliferation”为题2018年3月发表于《International journal of molecular sciences》杂志，其中RNA-seq部分在dafabet手机黄金版完成。

α-酮戊二酸可促胰腺祖细胞样细胞增殖

研究背景 

β细胞主要是由胰腺祖细胞样细胞分化而来。多项研究证实干细胞代谢在自我更新和增殖中起重要作用。在无葡萄糖的情况下，谷氨酰胺可为细胞分裂和生长提供能量；此外，谷氨酰胺合成的前体α-酮戊二酸（αKG）足以使非谷氨酰胺依赖性细胞增殖。

该实验证明αKG有助于胰腺祖细胞样细胞的大规模增殖，其可以提供足够量的临床相关β细胞。首先研究员从分子、生理等方面比较了小鼠胰腺CD133 +和CD133-细胞之间的代谢差异，然后采用实时PCR，免疫染色和传代检测来研究αKG存在是否影响3D培养系统中胰腺祖细胞样细胞的自我更新和增殖，结果发现在3D培养系统中，当向培养基中补充αKG时，胰祖细胞样细胞的增殖显着增加，并证实αKG的存在与Ten-Eleven易位（Tet）的上调相关，而αKG可通过上调Tet促进胰腺祖细胞样细胞的增殖。

研究思路

研究结果

1. 成年小鼠胰腺祖细胞样细胞代谢特点

为测试体内CD133+细胞和CD133-细胞之间的代谢差异，研究员利用流式细胞术从成年小鼠新鲜的胰腺细胞分选出CD133+和CD133-亚群（图1a）。

首先对参与氧化磷酸化和TCA循环相关酶的mRNA表达量进行了测定（1d）。结果表明，与CD133-细胞相比，CD133+细胞的能量代谢更依赖于氧化磷酸化。然后对CD133 +和CD133-细胞中葡萄糖TCA代谢物中间体进行测量，发现柠檬酸盐（CA），α-酮戊二酸（αKG），琥珀酸盐（SA）和富马酸盐（FA）在CD133 +细胞中含量较高，而糖酵解代谢物如乳酸在CD133-细胞中含量较高（图1e）。

此外，CD133 +细胞表现出高集落形成频率，而CD133-细胞不能形成环形集落（图1f）。从这些结果可以看出，小鼠胰腺中的CD133 +细胞是处于活跃状态而非静止。

图1 成年鼠胰腺中CD133 +和CD133-细胞的代谢水平

当氧化磷酸化升高时，活性氧（ROS）含量将增加。因此，ROS水平可用作氧化磷酸化的指示剂。研究人员测量了CD133 +和CD133-细胞中的ROS水平（图2a，b）、线粒体的数量（图2c，d）、ATP水平（图2e），结果均表明CD133+代谢活性高于CD133-。进一步研究两个细胞亚群的代谢途径，结果显示2-DG存在不影响CD133 +细胞能量代谢，寡霉素则对其具有显着影响。与之比较，CD133-细胞的能量代谢均受到显着影响，表明CD133+细胞的能量主要来源氧化磷酸化，而CD133-细胞的能量代谢依赖于氧化磷酸化和糖酵解（图2f，g）。

此外，研究人员用寡霉素处理CD133 +细胞，以干扰3D培养中细胞的增殖，观察到在寡霉素存在下，CD133 +细胞不能形成集落（图A3j，k），表明氧化磷酸化在CD133 +细胞的代谢中起重要作用。总之，这些数据表明从小鼠胰腺分离的CD133 +细胞具有更高的代谢率，并且与CD133-细胞相比，它们更容易发生氧化磷酸化。

图2 CD133 + / CD133-细胞中线粒体功能的分析

2. aKG促进胰腺祖细胞样细胞的增殖

添加寡霉素和αKG分别培养两类细胞，测量其ATP水平。结果显示有α-KG存在，CD133 +细胞的ATP水平增加，而CD133-细胞的ATP水平没有变化，这说明αKG影响CD133 +细胞中底物磷酸化的调节（图2h，i）。将αKG引入3D培养系统，祖细胞相关基因Pdx1，Sox9和Nkx2.2的表达显着增加，并且增殖标志物CyclinD1和Ki67也发生上调（图3a），添加一定浓度αKG（8mM）的菌落显示出更高的菌落形成频率（来自10,000个细胞），具有更大的菌落（图3b，c），并且胰腺祖细胞样细胞增殖（由每孔细胞数表示）和自我更新能力均增加（图3d，e）。

通过免疫荧光进行验证，发现Ki67，Sox9表达表达增加（图3f），此外三羧酸循环限速酶基因上调（图3g），该结果表明αKG在胰祖细胞样细胞的代谢中起调节作用。这些数据表明αKG可通过三羧酸循环促进Pdx1 + / Sox9 +胰祖细胞样群落的能量代谢，可以特异性地促进Pdx1 + / Sox9 +胰腺祖细胞样集落的增殖，增加体外胰腺祖细胞样群落形成频率，并改善祖细胞相关基因的转录。

图3 α-酮戊二酸（αKG）影响3D培养中胰祖细胞样细胞的增殖

3. 琥珀酸盐抑制胰腺祖细胞样细胞的增殖

琥珀酸是一种αKG依赖性双加氧酶竞争性抑制剂，可促进mESC的分化。研究人员使用4,12，16mM不同浓度的琥珀酸盐处理胰祖细胞样细胞，结果显示4mM琥珀酸盐处理下的菌落直径大于在12mM的（图4a），并且在琥珀酸盐处理下，多能性调控基因Pdx1和Sox9表达下调，而分化标志基因insulin1，Nkx6.1和Neurod1上调（图4b）；然而添加可透过细胞的琥珀酸盐导致集落形成频率降低和细胞数减少（图4c，d）。

研究人员进行了胰岛素分泌测定和KI67染色，发现在琥珀酸盐促使菌落的胰岛素分泌能力增加（图4e）以及KI67表达的降低（图4f）。这些结果表明，αKG抑制了胰祖细胞样细胞的增殖，并促进了与细胞分化相关的基因的表达。

图4 琥珀酸对3D培养中胰祖细胞样细胞增殖的影响

5. 通过Tet调节胰腺祖细胞样细胞的增殖

Tet是一种αKG和Fe2 +依赖性双加氧酶，它可以调节祖细胞相关基因的表达。αKG培养的胰祖细胞样细胞中Tet1，Tet2和Tet3上调（图5a），同时DNA甲基转移酶（DNMT）下调（图5b）。利用免疫荧光试验（图5c）测量了5-甲基胞嘧啶（5mc），发现在αKG下调了5mc的表达。

进一步研究胰腺祖细胞样细胞增殖是否与增殖相关基因启动子（如CyclinD1）的去甲基化相关，研究人员对αKG处理的3D培养系统中的菌落进行了甲基化特异性PCR（MSP）分析，发现CyclinD1基因启动子发生了去甲基化（图5d）。这些数据表明Tet酶在αKG促进的胰祖细胞样细胞增殖中的重要作用。

图5 检测αKG处理的菌落中的DNA去甲基化水平

6. 体外培养祖细胞样细胞与胰腺单细胞的KEGG通路存在明显区别

研究人员对体外培养的祖细胞样细胞与胰腺单细胞样本进行RNA-seq（表A1），发现基因在不同的KEGG上存在显著性的差异，并发现部分糖酵解相关酶在祖细胞样细胞中上调（图A1），而TCA循环相关基因均发生上调（图A2）。该结果也证实了体外培养胰祖细胞样细胞的可能性，并对上述实验给予了全局性的证明。

表A1 与胰腺单细胞相比，体外培养的祖细胞样细胞在不同KEGG通路存在显著基因改变

图A1  与胰腺单细胞相比，体外培养的祖细胞样细胞在不同KEGG通路存在显著基因改变，每列代表糖酵解相关酶的mRNA水平

图A2 与胰腺单细胞相比，体外培养的祖细胞样细胞在不同KEGG通路存在显著基因改变，每列代表三羧酸循环相关酶的mRNA水平

结论

• 该研究的目的主要为了体外培养胰腺祖细胞样细胞，以期获得足够量的临床相关β细胞。
•  该研究人员从正向促进和反向抑制两个方面设计实验，增加了实验结果的可靠性。
• RNA-seq结果的补充，不但增加了文章的数据量，从全局上说明了体外培养促进了胰腺祖细胞样细胞增殖，也说明了体外培养胰腺祖细胞样细胞的可能性。

参考文献：

Song J, Ma D, Xing Y, et al. α-Ketoglutarate Promotes Pancreatic Progenitor-Like Cell Proliferation[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(4).