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本文以“KSRP specifies monocytic and granulocytic differentiation through regulating miR-129 biogenesis and RUNX1 expression”为题于2017年11月发表于杂志《nature communications》，其中miRNA测序部分在dafabet手机黄金版完成。

KSRP通过调节miR-129生成和RUNX1表达来调控单核细胞和粒细胞分化

研究背景

 RNA结合蛋白（RBPs）可以调节RNA的加工，包括可变剪切，RNA运输与稳定，RNA定位等，但对骨髓细胞分化的作用还不清楚。

本文作者通过RNA测序研究RBP在骨髓分化时的作用，KSRP在单核细胞生成期间下调表达，在粒细胞生成期间上调表达，说明KSRP在单核细胞和粒细胞分化期间起相反作用。miRNA比较分析显示KSRP促进miR-129的生成，在骨髓分化时miR-129的表达模式和作用与KSRP相同。另外，miR-129直接抑制RUNX1的表达。KSRP, miR-129, RUNX1可形成一个调控轴控制骨髓分化。

研究结果

1、RBPs参与骨髓分化

作者使用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对造血祖细胞（HPCs）分别进行刺激15天，分化成单核细胞和粒细胞。M-CSF刺激5天后，单核细胞出现，随后巨噬细胞的数量增加。G-CSF刺激10天后，晚幼粒细胞比例逐渐超过早幼粒细胞，在15天后出现中性带细胞（图a）。

分别对分化5,10,15天的细胞进行RNA测序（图b）。差异分析获得1100（来自单核细胞分化）和1188（来自粒细胞分化）个差异基因，结合RBPDB和ATrRACT数据库，筛选出21和16个差异RBP基因（ 图c），有8个差异RBP基因是两组共有的（图e）。对这8个RBP基因进行qPCR分析，显示有7个基因与测序结果一致。其中KSRP基因在粒细胞分化后期表达量急剧增加，并且与在单核细胞分化时的表达模式相反（图g）。

2、KSRP在单核细胞和粒细胞中的表达模式和发挥作用相反

对脐带血CD34+ HPCs进行Western blotting分析， KSRP蛋白水平在单核细胞分化时逐渐下调，在粒细胞分化时逐渐上调（图a）。相似的表达趋势也发生在成人骨髓CD34+ HPCs中图b）。在PMA诱导下发生单核细胞分化的THP− 1和HL-60细胞系中，KSRP表达下调；而ATRA诱导下发生粒细胞分化的NB4 和 HL-60细胞系中，KSRP表达上调( 图c, d)。

作者对KSRP进行敲降实验，当KSRP被沉默后，促进单核细胞的分化，相反的，却抑制粒细胞的分化（图e, f,g,h）。吉姆萨染色实验显示，KSRP被敲低后，巨噬细胞数量增加，而带细胞和中性粒细胞数量减少（ 图f, g）。

3、KSRP在骨髓细胞中调节miRNA的合成

 作者对KSRP过表达的THP-1细胞进行poly(A)-enriched RNA (primary miRNA transcripts)测序和small RNA(mature miRNA transcripts)测序（图a），检测KSRP是否通过调节miRNA合成来负调控单核细胞/粒细胞分化。分析显示16个miRNA的合成被KSRP促进，1个miRNA的合成被抑制（ 图b, c）。当KSRP过表达时，显示13个miRNA的pri-miRNA表达量减少，成熟miRNA表达量增加；当KSRP敲降时，表达模式相反 (图d,e)。另外，作者还对经历单核细胞/粒细胞分化的细胞系做了实验，综上选择miR-129-5p进行下面的研究。

4、KSRP在骨髓细胞中调控pri-129-1的加工并与之结合

人类 miR-129有两个不同的基因组位点(miR-129-1 (7q32.1) and miR-129-2 (11p11.2))（图a），RNA测序分析发现reads主要来自miR-129-1位点，因此后续分析主要关注miR-129-1（下文简称miR-129）。pri-129-1在PMA诱导的THP− 1细胞中表达增加，在ATRA诱导的NB4细胞中表达减少，而pre-129-1和miR-129却与pri-129-1表达模式相反（图b），pri-129-1, pre-129-1, miR-129在HPCs中的表达结果与上述一致（ 图c, d）。当KSRP被过表达后，pre-129-1和miR-129表达增加，pri-129-1表达减少；KSRP被敲低后，三者表达模式相反( 图e)。

RNAfold软件预测KSRP与pri-129-1的结合位点，找到4个位于pri-129-1环区的结合位点 ( 图a)。RIP实验显示KSRP确实与pri-129-1结合(图b,c,d)。RNA pull-down实验 ( 图e,f)显示KSRP与pri-129-1高效地结合 (图g)。另外，通过 RNA pull-down实验还找到了KSRP真正的结合位点1,2,4 ( 图h)。

5、miR-129在骨髓细胞中靶向结合RUNX1

生物信息学分析预测RUNX1是miR-129的潜在靶标，萤光素酶报告实验证实miR-129可与RUNX1结合 (图a,b)。RUNX1在单核细胞分化时表达上调，粒细胞分化时表达下调，正好与miR-129的表达模式相反( 图c)。另外，miR-129过表达时，RUNX1表达被抑制；miR-129敲低时，RUNX1表达增加( 图d, e)。以上可说明RUNX1是miR-129的直接靶标。

为研究RUNX1是否参与miR-129调节的骨髓分化，HPCs被转导RUNX1载体，然后经历分化，结果发现RUNX1促进骨髓细胞分化，抑制粒细胞分化 ( 图f, g,h)。

6、KSRP在体内和miR-129发挥相同的作用

作者将lenti-GFP-或lenti-sh-KSRP-HPCs转入小鼠体内(10a)，结果显示在骨髓细胞中KSRP被敲低后，CD14表达增加，CD11b表达下降 ( 图b)。另外，作者又将lenti-129-或lenti-GFP-HPCs转入小鼠体内( 图c)，miR-129过表达后，会降低CD14+的比例，提高CD11b+ 细胞比例 (图d)。以上结果显示KSRP和miR-129在单核细胞分化是均起抑制作用，在粒细胞分化时均起促进作用。

基于以上结果，作者假设KSRP/miR-129/RUNX1 形成一个调控轴调节骨髓分化 (图e)，作者构建移植鼠（lenti-GFP, lenti-sh-KSRP or lenti-129）来证明该假设。的确，KSRP敲低会提高pri-129的水平，减少miR-129的水平(图f)。同时miR-129过表达会抑制RUNX1的表达( 图g)。所以KSRP的敲低会提高RUNX1的表达水平 (图h)。

参考文献

Zhao H, Wang X, Yi P, et al. KSRP specifies monocytic and granulocytic differentiation through regulating miR-129 biogenesis and RUNX1 expression[J]. Nature communications, 2017, 8(1): 1428.