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dafabet手机黄金版客户文章-巨噬细胞miR-28-5p-IL-34的反馈环路调节肝细胞癌转移，文章发表于杂志Hepatology。

题目：miR-28-5p-IL-34-Macrophage Feedback Loop Modulates Hepatocellular Carcinoma Metastasis

杂志：Hepatology         IF：11.055

实验方法：miRNA-sequencing （Illumina HiSeq 2500）

合作单位：复旦大学

摘要：

作者对miRNA进行测序鉴定出22个参与肝细胞癌（HCC）转移的miRNA。其中 miR-28-5p在肝癌细胞中表达下调，这与肿瘤转移、复发及低的成活率有关。生物功能研究显示在裸鼠体内 miR-28-5p的缺乏促进肿瘤生长和转移，而在体外却不能改变肝癌细胞的生物学特性。通过基因表达谱和生物信息分析，作者鉴定出miR-28-5p的靶基因白介素-34（IL-34），miR-28-5p 缺乏对HCC生长和转移产生的影响依赖于IL-34介导的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的渗透。另外，作者发现在 HCC细胞中通过转化生长因子-β1（TGF-β1），被miR-28-5p-IL-34介导的TAMs可抑制miR-28-5p的表达，形成一个miR-28-5p-IL-34-macrophage的正反馈循环。在临床HCC样本中，miR-28-5p 的表达水平与 IL-34 的表达和TAMs的数量成负相关。低miR-28-5p 表达量，高IL-34水平及高TAMs数量的病人有更短的存活期（OS）和复发时间（TTR）。

背景：

大约90%的癌症患者死亡是由癌细胞转移所导致，许多研究显示癌细胞的内部机制和外部微环境因子可导致肿瘤转移，然而由于转移过程复杂，对于这些机制的理解仍是不全面的。miRNA是一种小非编码RNA，研究已经证实其对肿瘤转移的调节起着关键作用，但是目前miRNA对肝细胞癌的影响还没有被完全阐明。

研究方法：

研究结果：

1. miR-28-5p的下调与HCC的转移及预后有关

本文分别对具有不同转移能力的肝癌细胞系（转移能力：MHCC97L＜MHCC97H＜HCCLM3）及移植瘤模型组织（HCCLM3-LM）进行miRNA测序，结果在这些样本中共找到22与转移能力相关的显著差异miRNA，其中12个miRNA与样本转移能力呈正相关，10个与样本转移能力呈负相关。有趣的是，miR-28-3p 和 miR-28-5p来自同一个转录本且表达量最丰富，并且与4个样本的转移能力呈负相关，因此作者重点关注这两个miRNA的作用。

作者评估了miR-28-3p 和miR-28-5p的表达水平，发现只有miR-28-5p在肝癌细胞中的表达量相比于正常细胞明显减少。另外，它在转移性的HCC细胞系中的表达量低于非转移性的HCC细胞系。作者还对miR-28-3p 和miR-28-5p进行了qRT-PCR检测，结果显示相比于正常组织，只有miR-28-5p的表达量在肿瘤中是显著下调的。此外，HCC转移或复发的病人的miR-28-5p表达量低于非转移或复发的病人。因此miR-28-5p表达量较高的病人比表达量低的病人预后效果好。

图1

2. 裸鼠体内 miR-28-5p的缺乏促进肿瘤生长和转移，在体外却不能改变HCC细胞的生物学特性

将带有miR-28-5p 和 anti-miR-28-5p的质粒分别转染到HCC细胞系和裸鼠体内，结果显示miR-28-5p的下调对HCC细胞增殖、转移、凋亡等功能没有产生影响。而在裸鼠体内，当miR-28-5p的表达量降低时，肿瘤体积显著增大，利用活体成像技术证实了这个结果。

图2

3. IL-34是miR-28-5p下游的直接靶基因

以上的体内外实验显示miR-28-5p 可能通过细胞的非自治机制来行使其肿瘤抑制功能，一种可能的非自治途径是通过调节分泌蛋白（如细胞因子、趋化因子）的产生影响肿瘤微环境，因此作者根据研究miR-28-5p与细胞因子/趋化因子的上下调关系及预测软件寻找靶基因，结果只有 IL-34符合预测条件。miR-28-5p与 IL-34 mRNA的3’UTR具有互补序列，qRT-PCR 和western blot 也证实miR-28-5p 在HCC细胞中过表达可显著减少 IL-34 的表达水平。反过来，miR-28-5p的敲除可明显提高 IL-34 的表达量。另外，miR-28-5p和IL-34 的mRNA、蛋白水平具有显著的负相关性。

图3

4. IL-34激活巨噬细胞中的 FAK 和 ERK1/2 信号，促进增殖和趋化性转移

本研究显示 IL-34可以体外诱导巨噬细胞的增殖和趋化性迁移，westernblot分析发现 使用IL-34处理巨噬细胞后 FAK 和 ERK1/2的磷酸化水平提高，而在加入CSF1R 抑制剂,  FAK 抑制剂或 ERK1/2 抑制剂后，巨噬细胞的增殖和迁移能力降低，这说明FAK 和 ERK1/2 信号的活化与 IL-34介导的巨噬细胞的增殖及趋化性有关。

图4

5. IL-34通过诱导TAM渗透促进HCC的生长和迁移

与 miR-28-5p相似，体外实验显示 IL-34的改变对HCC的生物学活性没有影响。人体内HCC模型分析显示IL-34可促进肿瘤生长和迁移，而IL-34 的下调抑制肿瘤增殖。研究还发现在IL-34含量较高的肝癌细胞中渗透的TAMs 数量也是更高的，而在含有 IL-34 的其他基质细胞中渗透的TAMs 数量并未发生变化。作者在小鼠体内的实验显示TAMs 的消耗几乎完全消除了IL-34对HCC增殖的影响。结果表明在体内 IL-34对HCC增殖的影响是受TAMs调节的。

图5

6. miR-28-5p的缺乏导致IL-34的上调，从而通过TAM渗透的介导促进肿瘤生长和转移

体外结果显示miR-28-5p的过表达抑制巨噬细胞的趋化迁移和增殖，与敲除IL-34的作用相同，然而 IL-34的过表达可消除这种影响。这表明miR-28-5p 在HCC中的缺乏可使IL-34上调，从而促进巨噬细胞的趋化迁移和增殖。体内实验结果显示IL-34 过表达或miR-28-5p的敲除会增加肿瘤体积，诱导更明显的F4/80+ TAM渗透，反过来，则会减少TAM的渗透数量。另外还发现TAMs的消耗会消除由于IL-34 的过表达或miR-28-5p的敲除对肿瘤所产生的影响。这表明miR-28-5p缺乏对HCC增殖产生的影响依赖于介导IL-34的TAM渗透作用。

图6

7. 源自TAM的TGF-β1肝癌细胞中抑制miR-28-5p的表达

先前研究发现TAM参与肿瘤增殖，在HCC细胞中的作用机制也已经被报道过，但作者发现将TAMs和HepG2一起培养后会导致miR-28-5p水平下降， IL-34表达量升高。另外将TAMs 和HCC细胞一起培养使肝癌细胞的趋化迁移和增殖能力提高，这种影响会因miR-28-5p过表达或IL-34的敲除而消失。作者通过ELISA实验在HCC细胞中找到了TAMs分泌的主要细胞因子，而只有TGF-β1通过TAMs显著增加了对miR-28-5p表达的抑制，因此推测在HCC细胞中通过TAMs对miR-28-5p的抑制主要依靠TGF-β1，在HCC细胞中形成一个miR-28-5p-IL-34-macrophage正向反馈循环。

图7

8. miR-28-5p,IL-34, TAMs对HCC病人预后的影响

作者对 380 HCC病人的预后情况进行调查，发现miR-28-5p,IL-34, TAMs的表达量与存活率、复发时间密切相关，具体如下图所示。

图8

参考文献：Zhou S L, Hu Z Q, Zhou Z J, et al. miR‐28‐5p‐IL‐34‐macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis[J]. Hepatology, 2016, 63(5): 1560-1575.