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lncRNA测序 | ALU序列的插入促使lncRNA反式调控基因的可变剪接
发布日期：2017-11-02浏览： 次
文章题目：Insertion of an Alu element in a lncRNA leads to primate-specific modulation of alternative splicing
中文译名：ALU序列的插入促使lncRNA反式调控基因的可变剪接
合作单位：中国科技大学
发表时间：2016.10
发表杂志：Nature structural & biology
影响因子：13.338
应用方向：lncRNA
研究发现：
1. 发现一个lncRNA--5S-OT（在真核生物中由5S rDNA转录得到）。
2. lncRNA--5S-OT在小鼠和人中顺式调控5S rRNA的转录。
3. 灵长类动物中反义的ALU序列被插入到5S-OT。
4. 在人类细胞中，5S-OT可以通过与靶基因Alu/anti-Alu序列配对以及与剪切因子U2AF65相互作用来反式调控多个基因的可变剪切。
 
研究结果展示：
 
1. 哺乳动物中5S rRNA重叠转录本的鉴定
 
在小鼠和人类中，作者鉴定了一个lncRNA，与5S rRNA序列重叠(Fig. 1a)，RT-PCR实验显示这个lncRNA是一个正义的转录本。另外，RACE, full-length RT–PCR 和 northern blots实验显示这个转录本在小鼠和人类中的长度分别是847 nt 和354 nt (Fig. 1b,c)，称为5S-OT。作者又通过一系列实验发现5S-OT （1）存在于小鼠和人类的所有细胞和组织；（2）可能是由pol II合成的转录本，并带有3’ poly(A)尾巴；（3）将pol II 抑制后导致5S-OT水平下降；ChIP显示结合到启动子上并在5S-OT的转录起始位点的第一个核小体附件形成peak；（4）5S-OT不能编码蛋白。
 
 
2. 5S-OT顺式调控5S rRNA的转录
 
抑制pol II 后可导致初期5S-OT和5S rRNA的生成减少(Fig. 1d)，结果表明5S-OT对5S rRNA的转录有顺式调控的作用。作者通过改变5S-OT的表达水平进一步研究其调控机制。siRNAs敲除5S-OT后导致初期5S rRNA生成减少(Fig. 1e)，利用ASO敲除5S-OT，结果一致。ChIRP实验显示5S-OT结合到5S rRNA的启动子上。以上结果表明5S-OT RNA可以与5S rDNA cluster的染色质结合，对促进5S rRNA 的转录有顺式调控的作用(Fig. 1f)。
 
   
 
3. 人类的5S-OT调节可变剪切
 
作者利用siRNAs对5S-OT进行敲除并进行RNA测序，在HEK293T 和HeLa中有200多个外显子发生显著改变(Fig. 2a–c)。对发生显著剪切变化的cassette exons进行定量，分别在293T 和 HeLa 细胞中发现102 和 146 个外显子有增加的inclusion及142 和125 exons 增加的 exclusion，作者称之为显著变化的h5S-OT-sensitive exons。western blotting验证显示不同转录本亚型的蛋白水平的变化与其mRNA水平变化一致。
 
与可变剪切比较，基因表达量的改变并不是非常显著的，在293T和HeLa细胞中分别有226和34个基因表达量发生显著改变。在小鼠细胞N2a中，敲除m5S-OT后，有98个cassette exons的可变剪切发生显著变化。另外，FISH实验证实5S-OT位于细胞核内，并且不仅仅存在于5S rDNA的基因座上(Fig. 2d)。以上结果表明h5S-OT可反式调控多个基因的可变剪切过程。
 
 
4. h5S-OT通过ALU配对调节可变剪切
 
h5S-OT是如何调控人类细胞中多个外显子的可变剪切的呢？
 
作者在h5S-OT的3’端发现含有反义ALU序列 (Fig. 3a)，是灵长目特有的转座因子。生物信息学分析显示90%以上带有h5S-OT-sensitive exons的基因前体mRNA含有ALU序列。
 
作者对h5S-OT-sensitive exons 上下游内含子进行了研究，发现ALU数量与对照组外显子相比没有明显差异(Fig. 3b)。
 
有趣的是，在敲除h5S-OT后，带有increased inclusion的外显子在其下游有更多的ALU序列，而带有increased exclusion的外显子在其上游有更多的ALU序列(Fig. 3c)。进一步分析显示h5S-OT sensitive exons 5′或 3′端的2KB区域内有更多的机会拥有ALU序列，对这个区域进行检测发现，在敲除h5S-OT后，带有increased inclusion的外显子在其下游有更多的ALU序列，而带有increased exclusion的外显子在其上游有更多的ALU序列(Fig. 3d,e)。
 
以上分析表明前体mRNA中ALU序列的分布与h5S-OT调节的外显子的inclusion或exclusion有明确的联系。
 
通过RNase-protection assays (RPAs)(Fig. 3f)发现h5S-OT在体外可以形成双链RNA，而缺乏ALU的RNA则不能。RNA pulldown和ChIRP 实验(Fig.3g,h,i)发现，8个h5S-OT-sensitive 基因的确与h5S-OT相互作用。以上结果表明h5S-OT通过与ALU配对调控可变剪切。
 
 
5. h5S-OT与U2AF65相互作用
 
h5S-OT对可变剪切的影响可能也受到蛋白的调节，因此作者进行pull downs实验发现h5S-OT可与剪接因子U2AF65结合 (Fig. 4a)。通过RNA immunoprecipitation (RIP)进一步证实两者确实相互作用(Fig. 4b,c)。在h5S-OT中含有polypyrimidine tract (Py)序列（由于ALU的插入所创建的），U2AF65可与Py结合，一系列验证发现， h5S-OT中的Py 是U2AF65的结合位点(Fig. 4d)。因此，由于ALU的插入所创建的PY位点对于招募U2AF65是重要的。
 
 
6. U2AF65和Alu pairing对于h5S-OT的反式作用都是需要的
 
为研究U2AF65 参与h5S-OT反式调节机制，作者将U2AF65敲低并进行RNA测序，发现在HeLa 和293T中分别有835和750个外显子被显著改变(Fig. 5a)，作者称它们为U2AF65-sensitive exons。在HeLa和293T细胞中，分别有158和100个外显子对U2AF65和h5S-OT均敏感 (Fig. 5b)，生物信息学分析显示这些外显子在exclusion或inclusion的变化中呈正相关 (Fig. 5c)。对U2AF65过表达并不能抵消因h5S-OT敲低所导致的可变剪切的影响，说明h5S-OT主要影响U2AF65的分布而非蛋白水平。h5S-OT 敲低后, 与h5S-OT-sensitive基因结合的U2AF65减少(Fig. 5g)，然而将h5S-OT过表达后增加了两者的结合(Fig. 5h)。体外剪接实验也发现同时加入U2AF65 protein 和 h5S-OT RNA 比只加入其中一种对C1ORF43 外显子的影响更明显(Fig. 5i)，表明h5S-OT 可招募U2AF65，需要U2AF65和Alu pairing来发挥其反式调控作用。 
 
 
7. 于h5S-OT来操控可变剪切的技术
 
将h5S-OT的Alu 序列替换成特定基因的反义序列，h5S-OT就可以干扰靶基因的剪切，这一结果显示h5S-OT可作为一项生物技术来调控靶基因的可变剪切(Fig. 7a)。靶向基因的外显子的上游内含子区域可增加相应外显子的inclusion(Fig. 7b)，靶向下游区域可减少外显子的inclusion(Fig. 7c)。h5S-OT是一个内源性的lncRNA，可以翻译调控可变剪切，招募剪切因子到mRNA前体。
 
 
参考文献：Hu S, Wang X, Shan G. Insertion of an Alu element in a lncRNA leads to primate-specific modulation of alternative splicing[J]. Nature Structural & Molecular Biology, 2016, 23(11): 1011-1019.
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