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Powerful! 单细胞转录组测序！
发布日期：2017-02-22浏览：
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加入barcode序列制备长片段文库
与Illumina测序平台高度兼容：HiSeq®4000/2500/NextSeq®/MiSeq®…
可用于基因组/外显子组测序、大基因组的denovo组装及单细胞测序
低DNA起始量（1ng inpute）
揭开短片段文库难以鉴定的基因组区域
Mbp水平的单倍体分型，结构及拷贝数变异检测
寻找短读长不能发现的突变信息、检测复杂的结构变异
Chromium单细胞3’可进行1000至10000 s个单细胞转录组分析
……
10x Genomics公司全新升级的ChromiumTM系统优势比比皆是。特别的，ChromiumTM系统能实现单细胞测序。
The ChromiumTM Single Cell 3’ Solution，在细胞水平进行高通量数字化基因表达谱分析，可对复杂细胞群进行深入分析。追踪单个细胞的表达谱，避免单个细胞的生物学相关信号被大量细胞的平均化测定掩盖。
目前单细胞测序已经广泛用于微生物学、神经学、人体发育、免疫、癌症、辅助生殖等领域的研究。
（图片来源10x Genomics官网，侵删）
A Powerful Solution for Single Cell Discovery
- 高效率：一天内完成从细胞悬液到cDNA文库构建所有的测序准备工作
- 灵活的处理能力：10min内处理100-80,000+个细胞
- 高细胞捕获效率：高达65%
下面，通过一篇文献小编带大家深入了解10x Genomics之单细胞转录组测序！
【案例分享】Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells
文章概况
单个细胞转录组的研究是理解复杂生物系统的基础，本文作者描述了一个基于油滴的系统-10X Genomics，能够计算每个样本中成千上万个单细胞mRNA的表达。油滴封闭只需6分钟，大约50%的细胞捕获效率，一次可做8个样本。
为了展示此系统的良好性能及应用，作者搜集了250000个单细胞的数据（来自29个样本）。
1. 利用细胞系及合成的RNA验证系统敏感性和检测罕见群体的能力。
2. 利用68000个外周血单核细胞（PBMCs）展示系统能够区分大的免疫群体。
3. 利用转录组数据中的序列变异检测器官移植病人的骨髓单核细胞（BMMCs）中宿主与供体细胞的嵌合情况。
这一分析能够了解供体与宿主细胞的相互作用以及监测治疗效果。
结果
基于微滴的平台能够标记成千上万的细胞
单细胞测序的微流体平台是基于GemCode技术，技术的核心是油滴包裹的凝胶珠（GEM），GEM在一个八通道的微流体芯片中产生，大约可形成10万个。每个凝胶珠带有大约750000个设计好的序列，每条序列分别包含(i) an Illumina P7 and R2sequence (read 2 sequencing primer), (ii) a 14 bp 10x Barcode, (iii) a 10bp randomer to index molecules (unique molecularidentifier, UMI)and (iv) a30bppoly-dTprimer sequence。GEM形成后，细胞裂解，凝胶珠也自动溶解释放大量的barcode序列，随后mRNA逆转录为cDNA。油滴破碎，cDNA为模板进行PCR扩增，然后将cDNA进行打断、加测序接头P5及测序引物R1等传统二代测序的建库过程。
利用细胞系及合成的RNA进行技术展示
为了评估系统性能，作者构建~1,200 人类细胞(293T) 和~1,200 老鼠细胞(3T3)的混合文库，Illumina NextSeq 500测序产生100000 reads/cells。基于UMI的数量分布，作者预测出1012个含有细胞的GEMs，分别有482和538个GEMs的reads比对到人类和老鼠的转录组。其中8个GEMs中同时含有人和老鼠的UMI，多重率为1.6%。在100000 reads/cells的测序深度，作者检测出人类和小鼠的基因中值大约为4500个，转录本中值大约为27000个。作者还将人工合成的RNA（ERCC）加入微流体芯片评估cDNA的转换效率。测序获得的UMI的平均数量与加入微流体的ERCC的分子数量具有高的相关性（r=0.96）。
体外混合样本中单一群体的检测
通过混合两种细胞系--293T 和Jurkat测试系统正确区分不同群体的能力，将293T 和Jurkat等量混合，主成分1（PC1）将细胞分为大小相等的两簇，根据细胞系特定表达的基因可区分两种细胞，在293T细胞中XIST基因优先表达，而在Jurkat细胞中CD3D优先表达。另外将1%293T 和99% Jurkat 细胞混合，这些细胞按照期望的比例分成两簇。作者还尝试利用Single Nucleotide Variant（SNV）对群体进行分类，在每一个293T或Jurkat细胞中大约有350 SNVs，分别选择只在293T 或Jurkat存在的高质量SNVs，然后基于这些SNVs对细胞打分。在1:1的混合样本中，45% 293T 细胞主要包含293T富集的SNVs, 50% Jurkat cells主要包含Jurkat富集的SNVs。以上结果表明检测的SNVs 也可以用作细胞分类。
大的免疫群体分类
作者研究外周血单核细胞（PBMCs）内的免疫群体，从一个健康的供体获得新鲜PBMCs，每个通道大约得到8000-9000个细胞，共获得约68000个细胞。利用PCA和K-means聚类方法将细胞显著分为10类，用t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (tSNE)呈现（Fig. 3b）。通过计算每个基因在某类别与其他类别间的表达差异，从而找到了每个类别特异表达的基因（Fig. 3c）。另外作者构建了10个亚群的转录表达谱，而层次聚类又将其分为11个亚群的参考转录组表达谱（Fig. 3j），分类结果与利用特异表达的基因进行分类的结果大体一致，尽管仍有一些T细胞边界模糊。
冻存的PBMCs单细胞表达谱
作者为了检测GemCode技术对临床研究中冷冻细胞的效果，将新鲜PBMCs冷冻后再进行相同的分析，结果显示检测到的基因和UMI数量与新鲜细胞非常相似(Supplementary Fig. 8b)，说明转换效率并未受冷冻的影响。另外，亚群所占比例也与新鲜细胞相似(Supplementary Fig. 8c)，这表明GemCode技术也适用于冷冻样本。
基因分型法描述混合样本中的单一群体
GemCode还可以通过分辨单细胞研究造血干细胞移植后供体和宿主细胞的嵌合状态。作者将供体B、C的PBMCs以不同比例（0-50%）混合。测序深度为15k reads/cell，每个细胞得到50个SNV，然后基于检测的SNV进行细胞分类。当次要群体的比例大于3%时可将其与主要群体分开(Fig. 4a, b)，小于3%则无法分离(Fig. 4c)。为了进一步验证此方法的优势，将B和C以50:50, 90:10 ，99:1三种比例混合，50:50, 90:10混合的两个群体可分离开，而99:1混合的样本次要群体无法检测出，这与上述结果一致(Fig. 4d)。
单细胞分析移植的骨髓样本
作者选择患有急性白血病（AML）的两个病人（AML027, AML035）在造血干细胞移植前后的BMMC样本，利用检测的SNV进行基因分型，AML027的BMMC可分为两个亚群，主要群体为宿主细胞，次要群体为共体细胞，与临床嵌合实验结果一致。而在AML035只检测到1个群体，并与供体细胞匹配，也与临床嵌合实验结果一致(Fig. 5a)。
另外作者利用SNV分析对AML病人移植前后的细胞进行分类，从分类结果可了解在移植前后的细胞组成情况(Fig. 5b,c)。
参考文献：Zheng G X Y, Terry J M, Belgrader P, et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells[J]. bioRxiv, 2016: 065912.
除单细胞转录组测序外，ChromiumTM系统在基因组测序、外显子组测序同样高效，更能带来高质量、低成本的二倍体de novo组装。
The ChromiumTM Genome Solution，在全基因组规模提供了全面的Linked-Read信息，可提供超长片段的全基因组信息，进行突变检出、单倍体分型和基因组结构鉴定。能够揭示遗传性疾病关键的变异，并发现与癌症相关的关键改变。
The ChromiumTM Exome Solution，Chromium Exome结合Agilent公司SureSelect™ 技术优化捕获探针（baits），提高SNP检出质量的同时也可进行低复杂及重复区域检测，Mbp水平的单倍体分型，结构及拷贝数变异检测。
The Chromium™ de novo Assembly Solution，利用Supernova™ Assembler系统可发现真实的基因组信息，并且成本低，质量高。不需要任何类型的参考序列，即可揭示样本特异性序列，研究二倍体基因组结构。
《Nature Methods》上发表过一种新的de novo人类基因组序列组装方法，正是基于10X Genomics的linked-read数据。
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