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题目：Auxin-independent NAC Pathway Acts in Response to Explant-Specific Wounding and Promotes Root Tip Emergence during De Novo Root Organogenesis in Arabidopsis

杂志：Plant Physiology         IF：6.841

实验方法：qRT-PCR and RNA-seq analyses(Illumina HiSeq 2000)

摘要

植物具有强大的再生能力修复其损坏的组织。新器官的形成是植物再生的一种类型，可从创伤或离体组织中产生新的根和嫩枝。作者先前通过研究拟南芥离体叶片的根部再生，结果显示创伤为整个的再生过程提供信号。然而对于创伤在再生过程中所起到的作用仍旧是未知的。本研究显示创伤不仅引起生长素调节的再生干细胞的分化，而且诱导NAC通路。NAC1转录因子基因在响应离体叶片的创伤时特异性地表达，但是在叶片来源的植物创伤处并未表达。NAC1的抑制严重影响新的根尖形成。然而NAC1发挥作用并未受到生长素的调节，并且可以调控CEP基因的表达。CEP基因可对细胞壁中伸展蛋白的降解起作用。总之，结果表明创伤对器官形成有多重作用并且NAC1可以调节器官再生时的细胞环境。

研究方法

qRT-PCR and RNA-seq analyses

测序平台：the Illumina HiSeq 2000 platform （dafabet手机黄金版完成）

实验结果

1. 特异性地响应离体组织创伤的NAC基因的鉴定  

作者发现离体叶片创伤处形成新根，而叶片来源的植物在创伤处没有形成新根（Figure1A,1B）。因此作者分别在这两个创伤处取样进行转录组测序，比较两组的测序数据，找到特异表达的基因及共表达基因(Figure1C)。在离体叶片创伤部位作者找到12个特异性表达的NAC基因，均显著上调。qPCR结果显示NAC1 和NAC1-RELATED1 (NAR1)在离体叶片根部再生时表达量显著增加，而在叶片来源的植物创伤部位表达量没有显著变化(Figure1D,1E)。

Figure 1. Identification of NAC genesinduced in response to wounding.

为了进一步研究NAC1 和NAR1的表达模式，作者进行了qPCR检测，结果显示在离体叶片根形成的过程中表达量一直增加(Fig.2A,2B)。作者还构建了NAC1pro: NAC1-GUS reporter line，结果显示在叶片离体两天后创伤部位GUS信号被观测到，而在叶片来源的植物创伤处却没有(Fig.2C,2D,2E,2F)。另外在离体叶片的多个创伤处能检测到GUS信号，而在未离体的叶片创伤处却没有(Fig.2G,2H)，并且在离体茎中也存在同样的现象(Fig.2I)。作者发现离体叶片创伤处接触到B5培养液，而叶片来源的植物创伤处却是暴露在空气中，因此也对其供应B5培养液，发现叶片来源的植物创伤处NAC1的表达量增加。这说明湿润的环境对于创伤部位组织的再生是很重要的(Fig.2J,2K)。

Figure 2.Expression patterns of NAC genes.

2. NAC1参与根的形成

作者为了探索NAC在根形成过程所起的作用，将SRDX与NAC1融合(NAC1pro: NAC1-SRDX transgenic lines)从而抑制NAC1的转录。与对照组相比，NAC1pro: NAC1-SRDX transgenic lines形成的根有缺陷(Fig.3A,3B,3D)。在35Spro:NAC1-SRDXlines中生根过程严重被阻碍(Fig.3C,3D)，另外对茎创伤部位根的再生也有明显的抑制作用(Fig.3E)。数据表明NAC通路参与拟南芥根的再生。

Figure 3. NAC1 isinvolved in de novo root organogenesis.

3. NAC1行使功能不依赖植物生长素调节的细胞分化

先前的研究结果显示创伤处干细胞生长素的积累会诱导细胞分化成含有WOX11基因的根细胞，再进一步分化成含有WOX5的根原基细胞。因此作者检测NAC1是否参与生长素调节的细胞分化。首先检测NAC1的表达是否受到生长素的控制。利用auxin reporter line DR5pro:GUS发现生长素在创伤区的叶肉和脉管中快速积累(Fig.4A,4B)，而加入生长素抑制剂NPA后生长素不能够积累(Fig.4C)，但是NAC1的表达未受影响(Fig.4D)。另外qPCR实验发现在生长素处理过2h后，生长素响应基因GH3.2表达量快速上升，而NAC1未发生变化(Fig.4E,4F)。以上结果表明生长素不能控制NAC1的表达。

作者又检测NAC1是否影响离体叶片的根形成时的细胞分化。将WOX11pro:GUS 和WOX5pro:GUS reporter lines引入35Spro:NAC1-SRDX transgenic lines中，结果发现WOX11(Fig.4,G-J)和WOX5(Fig.4,K–N)的表达未受到NAC1的影响。因此结果表明NAC基因与根产生时的细胞分化无关。

Figure 4. NAC1 acts independently of auxin-mediated cell fate transition

4. NAC1促进CEP基因的表达

为了分析受NAC通路调节的下游基因，作者构建NAC1过表达品系pER8:33FLAGNAC1，转录组测序分析显示NAC1过表达会诱导许多基因上调，其中KDEL-tailed Cysendopeptidase(CEP)-CEP1,CEP2显著上调。先前研究报道CEP基因参与细胞凋亡及细胞壁中伸展(EXT)蛋白的降解，伸展蛋白可参与细胞增殖及创伤愈合。qRT-PCR 结果显示在pER8:33FLAGNAC1中CEP1和CEP2上调表达(Fig.5C,5D)，而在35Spro:NAC1-SRDX 中CEP1和CEP2的表达部分被抑制(Fig.5E,5F)。以上结果表明在根形成过程中NAC1可能使CEP基因表达上调。

Figure 5. NAC1 promotes expression of CEP genes.

为了检测CEP和伸展蛋白是否参与根的形成，作者利用CEP1pro:GUS和EXT1pro:GUS reporter lines分析它们的表达模式，结果显示CEP1(Fig.6,A-D)和EXT1(Fig.6,E-H)表达量在离体叶片创伤部位快速增加。将CEP1及CEP2分别引入NAC1pro:NAC1-SRDX中，可以使离体叶片的生根能力部分恢复(Fig.7A,7B)。

Figure 6. Expression patterns of CEP1 and EXT1.

Figure 7.Overexpression of CEP partially rescues rooting defect in NAC1 pro:NAC1-SRDX.