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大疱性类天疱疮（BP）是一种2型炎症和免疫驱动的皮肤病，但对免疫环境，特别是BP中的免疫基质串扰的全面了解仍然难以捉摸。近期，山东第一医科大学皮肤病医院在期刊Nature communication 发表了一篇文章，题目为Single-cell transcriptomics analysis of bullous pemphigoid unveils immune-stromal crosstalk in type 2 inflammatory disease，应用单细胞转录组测序 （scRNA-seq）、细胞间通讯分析和体外功能分析，研究了Th2介导的免疫中IL-13相关的反应，并探索了免疫细胞和基质细胞之间复杂的相互作用，为未来的治疗研究提供了潜在的途径。

dafabet手机黄金版为该研究提供了单细胞测序技术服务。

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发表期刊：Nature Communications

影响因子：16.4

发表时间：2024.7.15

研究方法：单细胞转录组测序（scRNA-seq）、免疫组化染色（IHC）、ELISA

文章链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39009587/

本研究使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和体外功能分析，将Th2细胞、树突状细胞（DC）和成纤维细胞确定为关键的细胞群。IL13-IL13RA1配体-受体对被确定为BP中免疫基质串扰的最重要介质。值得注意的是，表达IL13RA1的成纤维细胞和DC对分泌IL13的Th2细胞有反应，从而放大Th2细胞介导的级联反应，这是通过成纤维细胞中PLA2G2A和髓系细胞中CCL17的特异性上调发生的，形成了免疫基质串扰不可或缺的正反馈环。此外，PLA2G2A和CCL17有助于BP患者致病性抗BP180-NC16A自身抗体滴度的增加。作者的工作为BP的发病机制提供了全面的见解，并展示了控制免疫基质相互作用的机制，为未来的治疗研究提供了潜在的途径。

深化了对免疫-成纤维细胞通讯的理解，并强调了IL13-IL13RA1轴在BP患者Th2介导的免疫中的作用，这对自身免疫性疾病的更广泛研究具有潜在意义。

1. BP病变的细胞组成

为了探索协调BP中已建立的Th2介导免疫的细胞和分子机制，作者在发现阶段对5个BP患者的病变皮肤和8个健康人的正常皮肤进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。质控后得到68374个皮肤细胞进行整合分析，鉴定到20个簇，注释为9种主要细胞类型：角质形成细胞（KC；KRT1、KRT5、KRT10、KRT14）、成纤维细胞（DCN、COL1A1、COL1A2）、树突状细胞/巨噬细胞（DC/Mac；PTPRC、CD68、CD1C）、T/自然杀伤（NK）细胞（PTPRC，CD3D、GNLY、NKG7）、内皮细胞（CD93、ACKR1、AQP1）、淋巴细胞（CCL21、LYVE1、TFF3）、黑素细胞（TYRP1、PMEL、DCT）、汗腺细胞（DCD、KRT19、AQP5）和平滑肌细胞（TAGLN、ACTA2、TPM2）。BP患者和健康对照组共享所有这些细胞亚型。与健康对照组相比，病变皮肤中T/NK和DC/Mac细胞的比例有所增加。免疫化学染色证实了BP患者病变内CD3+T细胞和CD68+巨噬细胞的增加。

图1 皮肤scRNA-seq免疫细胞亚聚类

2. BP病变的特征是2型免疫环境

鉴于划分免疫细胞群可能会揭示新的细胞类型特异性表达差异，作者对T/NK和DC/Mac簇的所有免疫细胞进行了亚聚类，划分了14个亚群。其中，6种T/NK亚群为记忆CD4 T、效应CD8 T、NK和gdT细胞、Treg、Th2和增殖T细胞；8个髓系细胞的主要亚群是LAMP3+DC、cDC2、CXCL1-high DC、CD163+Macro、FCN1+Macro，GPNMBhigh Macro、Langerhans细胞、pDC和肥大细胞。 

在6个T/NK亚群中，BP患者的病变样本中Th2（GATA3+IL13+）T细胞水平显著升高。此外，在BP病变中，观察到增殖T亚群（MKI67+STMN1+）的增加趋势，其表达了高水平的Th2相关标志物基因，包括IL13和IL5；对八个髓系亚群的比例分析表明，BP患者皮肤中的朗格罕斯细胞减少，而高表达2型趋化因子CCL17和CCL22的cDC2簇、LAMP3+DC和CXCL1-high DC簇显示出增加的趋势；M2型巨噬细胞CD163+宏簇，含有大量CD163、CCL18和CCL13，在病变BP中也显示出增加的趋势。所有这些都证实了BP病变的特征是2型免疫环境，Th2细胞和表达2型趋化因子的DC细胞急剧富集，M2巨噬细胞（CD163+Macro）和表达2类细胞因子的增殖T细胞呈上升趋势。

免疫荧光共染色还证实了BP患者病变内CD3+GATA3+细胞和CD3+IL-13+细胞（的相对扩增导致Th2细胞的增加，免疫化学染色证实了CD11c+DC细胞的浸润，主要在真皮大疱下方或附近。虽然由于DC的显著升高，BP中Lan-gerhans细胞在髓系细胞中的比例降低，但免疫组织化学染色显示它们的细胞数量是增加的，表明朗格罕氏细胞在BP发病机制中的重要性。总的来说，这些数据表明，BP患者的特征是淋巴细胞和髓系细胞都有2型免疫环境。

3. 成纤维细胞和角质形成细胞的成分差异

皮肤成纤维细胞（FBs）提供了一种机械弹性、粘性但有弹性的结构基础，它们具有异质性，参与多种皮肤病，包括特应性皮炎（AD）、白癜风和银屑病。作者探索了BP患者的FBs异质性，并确定了10个亚群。最大的FB群体簇0（CCL19+FB）表达APOE和C3以及炎性趋化因子CCL19和CCL2，是一种促炎性FB，据报道可以调节淋巴细胞和髓系细胞的募集和组织。簇1（APCDD1+FB）以APCDD1和WIF1的表达为特征，簇4（POSTN+FB）和簇5（ASPN+FB）以POSTN或ASPN为特征，分别被鉴定为分泌性乳头状FBs和间充质FBs。簇2（CFH+FB）表达补体成分基因（如CFD、CFH和C3），簇3（HSPA1A+FB）上调抗凋亡基因HSPA1A和HSPA1B40的表达，簇6（FBLN1+FB）被发现高度表达FBLN1、MFAP5和ANGPTL133。最后三个细胞数量较少的簇由簇7中的IGFBP2和FGFBP2（IGFBP2+FB）、簇8中的INHBA（INHBA+FB）、簇9中的TAGLN（TAGLN+FB）的特定生物标志物注释。这些簇的多样性和复杂性揭示了皮肤成纤维细胞内显著的功能异质性，反映了炎症、免疫反应、代谢和脂肪生成中的广泛潜在功能。此外，细胞组成分析显示，簇1（APCDD1+FB）FBs在病变BP样本中更为丰富。

角质形成细胞（KC）占测序细胞的大部分（49132个细胞）。作者发现12个亚类中有5个亚类存在显著的比例差异。这12个亚类可识别为7种KC状态。角质层KCs高度表达ASPRV1、LOR、FLG和FLG2，包括簇9和10。上基部KC特异性表达早期分化角蛋白（KRT1和KRT10），由簇0、簇2和簇7组成。外根鞘细胞对应于簇5，内根鞘皮脂腺（簇8）表达APOC1。基底KC高度表达KRT5、KRT14和KRT15，具体分为三个簇1、6和11。调节离子通道的簇（簇4）特异性表达“通道ATP酶”基因（ATP1B1、ATP1A1和SAT1）和“通道间隙”基因（GJB6）。促增殖KC（簇3）的特征是MKI67、STMN1、UBE2C和TOP2A的表达。健康对照（HC）样本中以0_上基部KCs、6-基底KCs为主，而7_上基部KCs、5-外根鞘细胞和3-增殖KCs主要由病变BP细胞组成。这些结果表明，BP患者和HC患者的皮肤中表皮隔室分布不同。

4. IL13-IL13RA1信号传导：BP患者Th2细胞与IL-13反应性成纤维细胞和髓系细胞沟通的关键介质

考虑到CellChat是一种能够从scRNA-seq数据定量推断和分析细胞内通讯网络的工具，作者对22个簇进使用CellChat分析进行了细胞通讯分析，以预测主要的信号输入和输出。

通过比较正常皮肤和病变皮肤之间的总体通信概率，作者发现15条信号通路仅在BP病变皮肤中富集，包括SPP1、IL4、CD23、TRAIL、IL10、CD226、SN、IL2、CD80、IL6、AGRN、KIT、CNTN、SEMA5和CADM，表明这些通路可能对疾病进展起关键作用。针对IL4信号传导分析发现，Th2细胞是BP患者中最突出的来源。在三种Th2细胞因子中，IL-13在mRNA和蛋白质水平上的表达均远高于IL-4和IL-5；同时，IL13-IL13RA1被确定为IL4信号传导中最重要的配体-受体对，有助于Th2细胞与6个不同簇的通信，包括两个成纤维细胞簇（CCL19+FB和APCDD1+FB）和四个髓系簇（LAMP3+DC、cDC2、GPNMBhigh Macro和Langerhans细胞）。综上所述，IL13表达的优势和IL13-IL13RA1对的意义表明IL13在BP发病机制中的关键作用。

5. 在IL-13反应性成纤维细胞中：PLA2G2A上调通过病变BP位点的CXCL12/CXCR4轴驱动免疫细胞聚集

为了进一步探索IL-13响应性成纤维细胞对疾病的贡献，作者首先在两个IL-13响应的成纤维细胞簇CCL19+FB和APCDD1+FB中进行了差异基因表达分析。分析表明，与对照组相比，病变BP中2型炎症（POSTN和TNC）、炎性细胞因子和趋化因子（CCL26和CCL19）基因上调。有趣的是，编码分泌钙依赖性磷脂酶A2的PLA2G2A，据报道可在乳腺癌中招募免疫细胞，在BP患者的CCL19+FB和APCDD1+FB中高度表达。然后发现PLA2G2A在所有皮肤细胞类型中仅在成纤维细胞中表达，且在病变BP患者的总成纤维细胞上观察到增加的趋势。此外，作者通过ELISA验证了BP患者血清中分泌的PLA2G2A的显著上调（图4d），血清PLA2G2A可作为评估疾病严重程度的有前景的标志物。为了进一步探索PLA2G2A的作用，作者用PLA2G2A重组蛋白处理THP1和Jurkat细胞，发现PLA2G2A促进了这两种细胞的迁移，表明CCL19+FB和APCDD1+FB通过过表达PLA2G2A吸引免疫细胞的潜力。免疫荧光分析还显示了PLA2G2A+成纤维细胞在CD68+巨噬细胞和CD3+T细胞之间的类似空间分布。

为了进一步探索PLA2G2A介导的免疫浸润的潜在机制，CellChat用于进一步分析这两个IL-13反应性成纤维细胞簇和其他簇之间增加的通信信号。MIF-CD74对是所有细胞簇中最稳健的信号，而CXCL12-CXCR4对是第二重要的信号，在成纤维细胞亚群中表现出显著的富集。然后选择了来源于FB0和FB1的CXCL12-CXCR4配体-受体对，据报道，该对在调节BP患者的B细胞运输和分化中起着致病作用。与健康对照组相比，CXCL12-CXCR4对在病变中也表现出高度活性，它们以旁分泌的方式从这两个成纤维细胞簇作用到几乎所有的免疫簇。表达谱和免疫荧光实验暗示CXCL12-CXCR4配体受体可能参与T/NK细胞的免疫浸润。

考虑到PLA2G2A和CXCL12/CXCR4的共同免疫募集功能，作者进一步探讨了成纤维细胞中PLA2G2A与CXCL12表达水平的相关性。在所有成纤维细胞中，PLA2G2A和CXCL12的表达均呈显著正相关，BP病变的相关性更强。然后作者用PLA2G2A重组蛋白处理外周血单个核细胞（PBMC），发现PLA2G2A增加了CD3+T细胞上CXCR4的表达，表明PLA2G2A可能通过CXCL12/CXCR4轴招募T细胞。总的来说，这些结果表明，成纤维细胞中PLA2G2A的过表达促进了通过CXCL12/CXCR4轴的免疫浸润。

6. BP患者IL-13反应性髓系细胞中CCL17增加

在免疫细胞浸润后，为了研究协调BP患者病变中2型免疫环境的细胞和分子机制，分析了专门针对Th2和表达2型细胞因子的增殖T细胞的相互作用对。CellPhoneBD的显著平均前50个相互作用对表明，CCL17-CCR4信号传导特异性来源于对Th2和表达2型细胞因子的促增殖T细胞有IL-13反应的DC簇。CellChat证实了CCL17-CCR4配体-受体对，有助于LAMP3+DC、cDC2和CXCL1高DC细胞与Th2和增殖T细胞的交流。

根据表达谱，作者发现CCL17仅由DC/Mac细胞产生。作者还通过ELISA验证了BP患者血清中CCL17分泌的显著上调。CCL17的受体CCR4仅由T细胞表达，但作者没有看到总T细胞和Th2细胞中CCR4表达的显著变化。同样，CCL17处理的重组蛋白不影响来自PBMCs的CD3+t细胞上CCR4的表达。考虑到CCR4的表达不变和CCL17的升高，作者推测CCL17参与了Th2介导的免疫的协调，而不是CCL17/CCR4轴招募T细胞。

7. 成纤维细胞来源的PLA2G2A驱动CCL17的分泌

尽管CCL17水平与临床表现之间的关系已被报道，但包括BP在内的皮肤病中CCL17上调的机制在很大程度上仍有待了解。鉴于DC和成纤维细胞都是对IL-13有反应的主要细胞类型，成纤维细胞中PLA2G2A表达的增加通过CXCL12-CXCR4吸引了包括DC在内的免疫细胞的浸润，然后作者对分别来自成纤维细胞和髓系细胞的两个关键因素PLA2G2A和CCL17进行了相关性分析。观察到血清中PLA2G2A和CCL17的分泌之间存在显著的正相关，PLA2G2A重组蛋白的治疗刺激了病例组和对照组PBMC分泌CCL17。为了探究CCL17是否由DC分泌，从BP患者和对照组中分离出的DC在体外用PLA2G2A刺激，导致刺激后CCL17的分泌增加。这些结果表明，成纤维细胞衍生的PLA2G2A可能会驱动BP患者骨髓细胞，特别是DC簇分泌CCL17。

8. PLA2G2A和CCL17在IL-13分泌中起着关键作用

然后，作者测试了CCL17在BP患者Th2（IL-13）介导的免疫中的作用。首先，在BP病例中，CCL17重组蛋白的治疗诱导了PBMC分泌IL-13的明显增加。最后，在体外用PLA2G2A治疗刺激PBMC和分选的T细胞可使IL-13的释放显著增加。总体而言，成纤维细胞来源的PLA2G2A驱动髓系来源的CCL17的分泌，这进一步诱导了IL-13介导的免疫在BP和2型炎症性疾病的发展中，表明PLA2G2A和CCL17是BP有前景的治疗靶点。

9. PLA2G2A和CCL17都能促进抗BP180-NC16A抗体的产生

在BP中，针对半桥粒蛋白BP180和/或BP230的自身抗体促进补体的激活、肥大细胞的脱颗粒和中性粒细胞的激活，导致表皮下起泡48的发展。因此，作者探讨了两种有前景的治疗靶点PLA2G2A和CCL17对抗BP180和抗BP230抗体分泌的影响。CCL17刺激的患者来源的PBMC上清液中的抗BP180-NC16A抗体滴度显著增加，但健康对照的上清液中没有。一致地，PLA2G2A刺激引发了BP患者外周血单个核细胞中BP180-NC16A自身抗体的产生，而不是健康对照组。

为了解决参与分泌抗BP180抗体的潜在机制，因此用PLA2G2A或CCL17刺激PBMC，以测试它们是否介导了BP中的B细胞分化。流式细胞术结果显示，PLA2G2A和CCL17均诱导BP患者CD138+浆细胞占总B细胞的比例显著增加。总的来说，成纤维细胞衍生的PLA2G2A和DC衍生的CCL17刺激了抗BP180-NC16A抗体的分泌，进一步阐明了BP的免疫发病机制，并证实CCL17和PLA2G2A是治疗策略的候选者。

10. IL13-IL13RA1介导的细胞间通讯畸变在PBMC和水疱样本中明显占主导地位

为了进一步支持在BP患者病变中观察到的不同亚群之间的串扰，作者对8名BP患者、8名健康人的PBMC，和4名BP患者的水疱进行了scRNA-seq，质控后分别获得了102483个细胞和19722个细胞。

在PBMC scRNA-seq数据集中，经过一系列聚类和重聚类分析，鉴定出21种细胞类型，包括主要的疾病相关细胞类型Th2、促增殖T和DC。通过CellChat分析，IL4信号被富集，并鉴定出几个配体-受体对。在IL4信号传导中的多个配体-受体对中，发现IL13-IL13RA1是主要的配体-受体配对，在BP患者中被激活，协调Th2/增殖T细胞和髓系细胞之间的相互作用，尤其是DC簇，这与在正常样本中观察到的相互作用是一致的。

与PBMC和病变样本相对应，在四个水疱样本中也观察到Th2/Tc2（簇6；CD3D、LMO4、GATA3、NBAS、IL17RB）和IL13/IL5表达的增殖T（簇12；CD3D，TYMS，MKI67，TOP2A）细胞。簇7被鉴定为嗜酸性粒细胞。CellChat分析显示，水疱样本中IL4信号的富集和IL13-IL13RA1配体-受体对的优势。尽管在Th2/Tc2和增殖T中也观察到IL13信号，但发现嗜酸性粒细胞是IL13信号的主要来源，树突状细胞和巨噬细胞是水疱样本中的主要受体。作者假设Th2细胞介导的级联反应促进了致病性抗BP180-NC16A自身抗体，招募嗜酸性粒细胞的浸润和IL-13的分泌，以进一步放大2型炎症。

总的来说，作者进一步验证了PBMC和水疱样本中的IL13-IL13RA1和CCL17-CCR4配体-受体对，建立了皮肤病变观察的准确性。

作者的研究提供了几个关键发现。首先，作者确定IL13-IL13RA1是IL4信号传导中的主要配体-受体对，促进Th2细胞和成纤维细胞/DCs之间的串扰，并放大Th2细胞介导的反应。此外，病变成纤维细胞中上调的PLA2G2A通过CXCL12/CXCR4轴招募免疫细胞，揭示了2型炎症驱动的皮肤病的进一步机制。最后，成纤维细胞衍生的PLA2G2A和髓系衍生的CCL17促进了致病性抗BP180-NC16A自身抗体的分泌，这点增强了对免疫细胞-成纤维细胞相互作用的理解，并为2型炎症性疾病的治疗途径提供了见解。

Liu T, Wang Z, Xue X, Wang Z, Zhang Y, Mi Z, Zhao Q, Sun L, Wang C, Shi P, Yu G, Wang M, Sun Y, Xue F, Liu H, Zhang F. Single-cell transcriptomics analysis of bullous pemphigoid unveils immune-stromal crosstalk in type 2 inflammatory disease. Nat Commun. 2024 Jul 15;15(1):5949. doi: 10.1038/s41467-024-50283-3. PMID: 39009587; PMCID: PMC11251189.