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客户文章丨Nat Commun|利用多组学测序技术揭示角蛋白功能丧失性突变导致毛发红糠疹的发病机制
发布日期：2025-02-17浏览：
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毛囊红糠疹（Pityriasis rubra pilaris, PRP）是一种炎性丘疹鳞屑性皮肤病，其特征包括毛囊角化性丘疹和红斑鳞屑斑块，目前PRP的致病机制尚未完全阐明。尽管CARD14突变已在家族性PRP病例中报道，但这部分患者仅占PRP的5%。因此，PRP更多的发病机制有待阐明。
山东第一医科大学附属皮肤病医院的张福仁/刘红团队在Nature Communications发表题为Loss-of-function mutations in Keratin 32 gene disrupt skin immune homeostasis in pityriasis rubra pilaris 的论文。本研究联合多组学技术（WES/RNA-seq/Mass Spectrometry），发现KRT32杂合突变与PRP患者存在显著关联。KRT32通过调节NF-κB信号通路对炎症信号通路具有抑制作用，其功能丧失突变导致角质形成细胞免疫调节失衡，促进了PRP的发展。这一发现为PRP的病因和病理机制提供了新的见解，并为KRT32作为治疗靶点的可能性提供了理论依据。
dafabet手机黄金版有幸为该研究提供了RNA-seq、WES服务，下面就由小编和大家分享此文章～
文章简介
标题：Loss-of-function mutations in Keratin 32 gene disrupt skin immune homeostasis in pityriasis rubra pilaris
发表期刊：Nature Communications
影响因子：14.7
发表时间：2024.7.24
研究方法：WES、RNA-seq、Sanger、Mass Spectrometry、GST pull down
文章概要
本研究共纳入了102例散发性PRP患者和800名健康对照汉族人群，并确定PRP与KRT32杂合突变之间的显著关联（P=1.73x10^−6）。KRT32主要定位于基底角质形成细胞，并通过拮抗NF-κB通路对皮肤炎症有抑制作用。在机制上，KRT32与NEMO结合，促进过量的K48连接的多聚泛素化和NEMO降解，从而阻碍IKK复合物的形成。相反，PRP患者中KRT32的功能缺失突变导致NF-κB过度激活。重要的是，Krt32敲除小鼠表现出PRP样皮炎表型，表明角化细胞在响应外部促炎刺激时抗炎功能受损。这项研究提出了KRT32在调节炎症免疫反应中的作用，KRT32的破坏性变异是PRP发展的重要驱动因素。这些发现为角蛋白对皮肤免疫稳态的调节提供了新的见解，并开辟了将KRT32作为PRP治疗靶点的可能性。
技术路线
研究亮点
揭示了PRP新的致病突变基因和位点（KRT32），并阐明了该基因突变导致PRP的分子机制。
研究结果
一、利用WES发现了PRP患者强相关的突变基因KRT32并预测了突变导致的蛋白结构破坏
发现队列中，作者对58名PRP患者和364名健康对照者进行了WES测序，共鉴定出15988个罕见有害变异，涉及8397个基因。基因负荷分析显示KRT32基因与PRP显著关联（P = 3.06 x 10−4），并在57例分析的病例中发现4个个体（7.02%）携带KRT32突变。验证队列共44名PRP患者和436名健康对照者，并通过Sanger测序发现了2个新的KRT32有害突变，与对照组相比存在显著差异（P = 8.23 x 10-3）。将发现队列和验证队列的数据合并后，KRT32基因的关联性达到了高度统计显著（P = 1.73 x 10-6）。使用AlphaFold对KRT32蛋白进行结构预测，发现这6个突变位点集中在KRT32预测模型的中间区域。且在这四个物种中完全保守，该区域的突变可能会对KRT32的结构以及功能造成影响。
表1 患者与对照组中KRT32破坏性突变的携带率
图1 PRP患者KRT32蛋白损伤突变位点的定位
二、KRT32损伤突变促进PRP患者皮肤层细胞增殖并改变其表达模式
为了研究KRT32的组织特异性表达模式，作者分析了数据集HPA（人类蛋白质图谱）和GTEx（基因型-组织表达）。KRT32在皮肤和食道组织中表现出高表达，尤其是在人皮肤的基底角质形成细胞中。此外，IHC显示，在PRP患者的皮肤中，KRT32突变导致表皮层变厚，角质形成细胞增殖增加。细胞增殖实验（如CCK-8和EdU实验）表明，KRT32的敲低促进角质形成细胞增殖，而KRT32的过表达则显著抑制细胞增殖。综上所述，KRT32在抑制角质形成细胞增殖中起着关键作用，但PRP中KRT32突变失去了这一功能。
图2功能缺失的KRT32突变促进角质形成细胞增殖
三、KRT32介导PRP发生的分子机制
（1）KRT32是NF-κB介导的炎症反应的负调节因子
为了研究KRT32损伤变异如何影响PRP疾病进展的机制，研究人员对6例KRT32突变患者皮肤FFPE切片及体外Ker-CT细胞系进行了RNA-seq。结果显示，KRT32突变促进p65磷酸化，同时激活了TNF通路，并且由破坏性变异引起的功能丧失突变导致NF-κB的过度激活。结合MSD法检测KRT32敲低的Ker-CT细胞上清液中IL – 1β、IL-6、IL - 8的分泌情况，发现KRT32的敲低会导致NF-κB活性和促炎因子分泌的增加。
图3 KRT32抑制NF-κB信号通路的激活
（2）KRT32通过与NEMO结合调控NF-κB信号通路活性
紧接着为了进一步阐明KRT32相关的NF-κB信号通路负调控的分子机制，作者联合GST-pull down/蛋白质谱/WB等技术，发现了KRT32可以和NEMO直接结合。且KRT32通过促进NEMO的K48连接多聚泛素化和降解，阻止IKK复合物的形成，从而抑制NF-κB信号通路的激活。以上结果表明，KRT32通过与NEMO结合以及随后发生UPS介导的蛋白质降解，抑制IKKα/IKKβ磷酸化和IKK复合物的形成，而KRT32突变后则失去这种功能，导致NF-κB过度活化。
图4 KRT32通过与NEMO直接结合调控NF-κB信号通路
四、Krt32敲除小鼠表现出PRP样皮肤炎症表型
最后，作者利用CRISPR-Cas9技术构建KRT32敲除鼠。在TNF处理后表现出明显的皮肤增厚和广泛的黄鳞，与人PRP的皮肤表型相似。HE染色显示敲除小鼠的表皮增厚、角化过度、轻度淋巴细胞浸润和毛囊角栓。RNA-seq分析显示Krt32敲除小鼠中NF-κB和TNF信号通路显著富集，RT-qPCR也证实了这些结果。WB结果显示，Krt32敲除后NEMO和磷酸化p65水平明显升高。以上多重实验证据表明，小鼠表皮细胞中的KRT32与NEMO相互作用，抑制NF-κB通路的激活，维持皮肤免疫稳态。
图5 TNF诱导Krt32 KO小鼠的皮肤表型
结论与展望
本研究确定了KRT32中6个功能丧失突变，这些突变阻碍了KRT32结合和抑制NEMO表达的能力，从而损害了IKK复合物的形成。因此，它们触发角质形成细胞中NF-ΚB通路的上调，导致免疫调节失衡。揭示了角蛋白家族成员在介导炎症反应中的作用及其在PRP发病机制中的作用。在NF-ΚB信号通路中发现KRT32和CARD14的共同结合蛋白NEMO，为PRP的治疗干预提供了一个潜在的靶点。
参考文献
[1] Shi P, Chen W, Lyu X, Wang Z, Li W, Jia F, Zheng C, Liu T, Wang C, Zhang Y, Mi Z, Sun Y, Chen X, Chen S, Zhou G, Liu Y, Lin Y, Bai F, Sun Q, Ogese MO, Yu Q, Liu J, Liu H, Zhang F. Loss-of-function mutations in Keratin 32 gene disrupt skin immune homeostasis in pityriasis rubra pilaris. Nat Commun. 2024 Jul 24;15(1):6259. doi: 10.1038/s41467-024-50481-z. PMID: 39048559; PMCID: PMC11269665.
