dafabet手机黄金版_dafabet黄金手机版

2024年1月20日，复旦大学樊嘉、周俭、施国明和中国科学院神经科学研究所孙怡迪共同通讯在Nature Communications发表题为“Macro CD5L+ deteriorates CD8+T cells exhaustion and impairs combination of Gemcitabine-Oxaliplatin-Lenvatinib-anti-PD1 therapy in intrahepatic cholangiocarcinoma”的研究论文，该研究基于单细胞转录组测序和TCR测序技术表征了肝内胆管癌患者在接受吉西他滨（gemcitabine）联合奥沙利铂（oxaliplatin）、仑伐替尼（lenvatinib）和抗PD1抗体治疗前后病灶处肿瘤微环境的动态变化，揭示了GOLP治疗iCCA的潜在机制。该研究研究分析了18例患者的样本，发现CD8 GZMB+和CD8增殖T细胞的高比例以及Macro CD5L+的低比例与良好的治疗反应相关。在治疗效果不佳的患者中，虽然CD8 GZMB+和CD8增殖T细胞的比例有所增加，但CD8 GZMK+的比例在治疗后却有所下降。这些发现揭示了Macro CD5L+可能在削弱CD8+ T细胞功能和影响联合治疗效果方面发挥了不利作用。

dafabet手机黄金版有幸为其研究在单细胞测序方面提供了技术支持。下面就由小编和大家分享该文章。

题 目：Macro CD5L+ deteriorates CD8+T cells exhaustion and impairs combination of Gemcitabine-Oxaliplatin-Lenvatinib-anti-PD1 therapy in intrahepatic cholangiocarcinoma

期 刊：Nature Communications

影响因子：16.6

发表时间：2024.1

涉及的dafabet手机黄金版服务产品：单细胞测序

DOI：10.1038/s41467-024-44795-1

肝内胆管细胞癌（iCCA）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，仅次于肝细胞癌（HCC），为第二常见的原发性肝癌。近30年来，iCCA的发病率上升，由于其侵袭性和治疗手段有限，患者常在晚期被诊断，预后不佳。吉西他滨为主的化疗是晚期iCCA的首选治疗，但缓解率较低。靶向治疗和免疫检查点抑制剂（ICI）在其他癌症中取得进展，但大多数iCCA患者受益有限。部分iCCA患者存在FGFR信号异常或PD1/PD-L1通路激活，提示需要针对性治疗。联合疗法已成为提升治疗效果的策略。

最近，一项ii期临床试验(NCT03951597)的结果GOLP（吉西他滨（gemcitabine）联合奥沙利铂（oxaliplatin）、仑伐替尼（lenvatinib）和抗PD1抗体）联合治疗作为晚期iCCA患者的一线治疗，ORR为80%，中位OS为22.5个月。CSCO于2021年推荐此方案作为晚期iCCA的一线治疗。尽管DDR突变与肿瘤应答相关，但GOLP有效应答的决定因素仍不明确。

单细胞测序在了解肿瘤免疫微环境的复杂特征方面具有多项技术优势，并在多种癌症中应用。最近，几项研究产生了HCC和iCCA的单细胞图谱，破译了具有不同复发阶段的HCC病例的不同免疫生态系统，提供了宝贵的研究资源，但探索阐明 iCCA 联合治疗结果的决定因素迫在眉睫。此外，化疗药物或靶向药物已被证明可以重塑肿瘤微环境 （TME） 并增强肿瘤对抗PD1治疗的敏感性。因此，有必要系统地评估GOLP治疗方案在iCCA的TME中发生的动态变化情况。

文章模式图（图源自Nature Communications ）

1、GOLP方案对iCCA有较高的疗效

研究人员检索了2010年以来包括iCCA在内的33项BTC一线治疗临床试验的公开数据(https://clinicaltrials.gov/) ，总结了不同治疗方案的客观缓解率（ORR）、中位无进展生存期(mPFS)和mOS。在14项临床试验中，采用不同策略的iCCA患者的ORR为13.5 - 80%。之前的研究表明，GOLP方案治疗晚期iCCA的ORR最理想(80%)，而仑伐替尼+抗pd1抗体或GEMOX治疗晚期iCCA的ORR约为30%。为了进一步验证，使用两种小鼠细胞系（mIC-22，AY-LTC2）构建荷瘤的CL57BL/6小鼠实验验证三策略联合治疗比单一或两种联合治疗效果更好。这些结果表明，在临床实践中GOLP是治疗iCCA的有效策略。

图1. GOLP方案治疗iCCA疗效显著

2、单细胞图谱显示了GOLP处理iCCA后的动态变化

研究人员通过单细胞RNA和TCR测序分析了预治疗/GOLP治疗后的iCCA样本，以及未治疗的晚期iCCA患者样本，旨在探索GOLP疗法的作用机制。实验共获得了131,139个细胞，归类为12种细胞类型，免疫细胞包括：T细胞、髓系细胞、NK细胞、B细胞、中性粒细胞、浆细胞、浆细胞样树突状细胞以及肥大细胞。非免疫细胞包括上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及肝实质细胞。

研究显示，GOLP治疗后，T细胞、髓系细胞和成纤维细胞数量增加。为了进一步探讨细胞亚群与GOLP治疗反应之间的相关性，研究人员采用了预测指数(Pi)和治疗指数(Ti)分析，发现治疗前高比例的浆细胞、成纤维细胞和T细胞与良好的GOLP治疗响应相关，而高比例的髓系细胞和NK细胞则与不良响应相关。

图2. 在GOLP处理过程中iCCA微环境的单细胞图谱

3、四个肿瘤细胞簇对GOLP治疗有不同的反应

在iCCA肿瘤样本中，非免疫细胞主要是上皮来源的肿瘤细胞，高表达KRT19和EPCAM。通过分析单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据，确认了这些肿瘤细胞的基因拷贝数变异(CNVs)与实体瘤的增长特性相符。研究还发现，这些CNVs与之前报告的胆管癌染色体畸变模式非常相似。

进一步探究GOLP治疗对肿瘤细胞的影响，研究对治疗前后的肿瘤细胞进行了差异表达基因的功能富集分析。结果表明，治疗前的肿瘤细胞主要与新陈代谢相关，而治疗后则转向与炎症、细胞激活和适应性免疫反应相关的途径。值得注意的是，治疗前肿瘤细胞中某些基因如CD274、HLA-A、PCNA、FGF11和FGF18的高表达，预示着肿瘤有较好的缩小趋势。GSEA分析揭示，对GOLP治疗有良好反应的患者的肿瘤细胞中，PD1信号、血管发育和KIT信号等途径被激活。

通过非负矩阵分解（cNMF）分析，识别了iCCA中的四个基因共表达模块，并对每个模块的特异基因进行了功能富集分析。结果显示，这些模块具有其特定功能：C1涉及免疫应答和抗原处理，C2涉及ATP代谢，C3涉及解毒和炎症负调控，C4涉及AP-1途径。在治疗响应组中，C1和C3表达水平较高，这与GOLP治疗的反应有关。Bulk RNA-seq数据也证实了这些功能模块的存在。因此，高表达C1/C3相关基因的iCCA患者更可能从GOLP治疗中受益。

图3.肿瘤特征与iCCA预后和GOLP反应相关

4、Macro CD5L+比例高的肿瘤对GOLP治疗不敏感

髓系细胞是肿瘤微环境(TME)中的关键因素，能够调节T细胞的免疫反应。研究发现未治疗前肿瘤样本中髓系细胞中富集的基因与先天免疫反应和炎症反应显著相关，在GOLP治疗后的样本中髓细胞中富集的基因与适应性免疫反应有关。

研究人员进一步分析了iCCA中的髓系细胞，鉴定出三种主要类型：巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞(DCs)，并细分为多个亚群。尽管GOLP治疗导致髓系细胞扩增，但大多数亚型在不同患者中普遍存在，显示了患者间的异质性和治疗过程中的动态变化。特别是，治疗前Macro CD5L+细胞的高比例与对GOLP治疗的不良反应相关。多重免疫组化分析显示，对GOLP治疗反应差的患者的肿瘤样本中，Macro CD5L+细胞的数量远多于反应良好的患者。Macro CD5L+细胞表现出M2抗炎和吞噬特性，不表达MDSC标记物。因此，治疗前的Macro CD5L+比例可能预测iCCA对GOLP治疗的反应。

图4.RT改变了与临床结果相关的单核/巨噬细胞分化状态

5、高CD8 GZMB+基线水平预示着对GOLP治疗的良好反应

T细胞和NK细胞共分为12个亚群，包括2个NK细胞亚群，4个CD4+ T细胞亚群，5个CD8+ T细胞亚群，以及γδT细胞。GOLP治疗后，特定CD4+ T细胞亚群的比例发生变化，其中CD4 SOCS3+和CD4 CXCL13+的比例增加，而CD4 naive的比例减少。相关性分析显示，CD4 CXCL13+与PD-L1阻断治疗在三阴性乳腺癌中的效应一致，并且这种T细胞亚型高度表达PDCD1，暗示其在GOLP治疗iCCA中可能的预测作用。另外，CD4 Treg细胞的表现与GOLP治疗反应不良相关。

对于CD8+ T细胞亚群，治疗前高比例的CD8增殖T细胞和CD8 GZMB+细胞预示着对GOLP的良好反应，这些细胞也表现出较高的PDCD1表达。此外，CD8 GZMK+细胞的增加与GOLP治疗的良好反应和肿瘤缩小程度密切相关，且GZMK的高表达与iCCA患者的良好预后有关。

综上所述，CD8 GZMK+细胞可能在iCCA患者中起到保护作用。流式细胞术和多重免疫组化的结果表明，治疗前CD8 GZMB+细胞的丰度可以作为GOLP治疗响应的有效预测因子。

图5. 高CD8 GZMB+基线水平预示着对GOLP治疗的良好反应

6、GOLP治疗后CD8增殖、CD8 GZMB+和CD8 GZMK+的动态变化

研究人员使用配对的TCR测序数据分析了GOLP治疗后iCCA患者T细胞克隆型的变化。结果显示，在8例患者中，7例的共享CD8+ T细胞克隆型比例显著增加，且CD8+ T细胞亚型间共享的克隆型比例高于CD4+ T细胞。通过比较治疗前后样本中的T细胞克隆丰度，研究人员发现，GOLP治疗后克隆丰度增加的是扩增或新型TCR克隆，而丰度降低的则是收缩TCR克隆。扩增的CD8+ T细胞表现出耗竭特征基因，并与良好的GOLP治疗反应相关；相反，收缩的CD8+ T细胞表达激活特征基因，与较差的治疗反应相关。

研究还发现，扩增的CD8+ T细胞主要为CD8 GZMB+、CD8 GZMK+和CD8增殖T细胞，这些细胞类型在GOLP治疗后显示出高度活跃性。此外，GOLP治疗后反应不佳的患者中，CD8T细胞的耗竭特征评分降低，表明治疗改变了免疫微环境。流式和多重免疫荧光分析也表明，反应不佳的患者有更多CD8 GZMB+和CD8增殖T细胞，而反应良好的患者则有更多CD8 GZMK+细胞。

图6.TCR克隆型扩增和CD8增殖到CD8 GZMB+到CD8 GZMK+过渡对GOLP反应的影响

7、CD8增殖和CD8 GZMB+向CD8 GZMK+的转变影响了对GOLP的反应

研究人员深入分析了GOLP治疗后最活跃的CD8+ T细胞亚型：CD8 GZMB+、CD8 GZMK+和CD8增殖T细胞。发现这些细胞亚型之间具有较高的克隆相似性，表明它们可能源自相似的细胞群。使用Monocle2软件进行细胞轨迹分析，确定了CD8+ T细胞亚型存在四个不同的转录状态，其中CD8增殖T细胞主要处于细胞周期活跃的早期阶段；CD8 GZMB+处于中间阶段；而CD8 GZMK+则集中在最终阶段，并具有最高的细胞毒性和最低的衰竭水平。

研究还揭示了这三种CD8+ T细胞亚型在GOLP治疗后的功能状态变化。良好的治疗反应与CD8+ T细胞衰竭评分的显著下降有关，尤其是当CD8增殖T细胞成功分化为CD8 GZMK+时。相反，如果这种分化受阻，患者的衰竭评分会上升，导致治疗效果不佳。

此外，高比例的CD8 GZMK+ /CD8增殖T细胞或CD8 GZMB+ /CD8增殖T细胞与良好的GOLP治疗反应相关。这表明，CD8增殖T细胞和CD8 GZMB+向CD8 GZMK+的成功转化对于实现GOLP治疗的有效反应至关重要。

8、Macro CD5L+加重对GOLP反应不良的患者的CD8 GZMB+的衰竭

研究人员使用RNA velocity分析了不同患者对GOLP治疗的反应，发现反应不同患者的CD8 GZMB+细胞群存在显著差异。对比反应良好和反应较差的患者后发现，反应良好的患者中CD8 GZMB+ TCR克隆扩增比例更高，衰竭评分更低，并且与适应性免疫应答相关的基因表达增加。相反，在反应较差的患者中，CD8 GZMB+细胞的特征基因与细胞因子信号传导相关，STAT和IRF家族的转录因子活性上调，表明细胞因子信号可能促进了CD8 GZMB+的耗竭状态。

CellChat分析揭示了Macro CD5L+和其他细胞类型之间的细胞因子信号交流，特别是Macro CD5L+对CD8 GZMB+的影响。实验验证表明，Macro CD5L+通过分泌蛋白CD5L重塑了CD8 GZMB+的耗竭状态，这一过程不依赖于PD1。相互作用分析进一步显示，Macro CD5L+和CD8 GZMB+主要通过CD5L和CXCL12通路进行通信，特别是在GOLP治疗反应较差的患者样本中，STAT1调控的下游基因在CD8 GZMB+中表达上调。

综上所述，Macro CD5L+可能通过激活STAT1等转录因子，增强CD8 GZMB+的耗竭状态，从而在GOLP治疗反应不佳的iCCA患者中影响治疗效果。

图7. Macro CD5L+加重了对GOLP反应不良的患者的CD8 GZMB+的衰竭

9、抗ctla4抗体逆转iCCA中的GOLP耐药性

研究人员构建了两种小鼠iCCA模型来研究Macro CD5L+在GOLP治疗中的作用。通过肝脏原位注射形成的肿瘤中检测到了Macro CD5L+，而皮下注射模型则未检测到，说明Macro CD5L+主要在肝脏中存在。这些细胞特有地表达FOLR2膜蛋白，使其能被用作分选Macro CD5L+的标记物。将分选出的Macro CD5L+注入皮下iCCA模型后，发现这些小鼠对GOLP治疗的反应减弱，表现为较大的肿瘤体积，表明Macro CD5L+可能引起对GOLP的耐药性。

进一步的研究通过对小鼠进行GOLP治疗并分析肿瘤组织的单细胞测序数据，揭示了CD8+ T细胞可分为六个亚群，其中部分与人类的CD8 T细胞亚群具有相似的基因表达谱。特别是，注射Macro CD5L+的小鼠中，类似人类CD8 GZMB+的亚群（C0和C1）显示出Ctla4、Tox和Tox2的高表达。这些结果提示Macro CD5L+可能通过上调这些基因导致GOLP耐药。

使用抗Ctla4抗体处理注射了Macro CD5L+的小鼠，能够有效逆转GOLP耐药性。此外，尽管CTLA4在小鼠Treg细胞中也有表达，但Macro CD5L+并未增加其表达，这表明Ctla4介导的耐药性逆转不涉及CD4 Treg细胞。临床数据分析也显示，在GOLP治疗后反应不佳的患者中CTLA4表达较高，这指出CTLA4可能是逆转GOLP耐药性的治疗靶点。

图8. 抗ctla4抗体逆转了iCCA中的GOLP耐药性

该研究利用scRNA和TCR测序表征了GOLP治疗前后的iCCA高分辨率的分子图谱，阐明了GOLP治疗敏感的细胞类型和预测治疗反应的关键细胞亚型，揭示了CD8+ T细胞的动态变化对GOLP治疗iCCA的潜在影响，并强调了 CD5L+巨噬细胞诱导的T细胞耗竭对联合治疗的影响，为iCCA的个性化和优化治疗奠定了理论基础。

复旦大学中山医院樊嘉、周俭、施国明和中国科学院神经科学研究所孙怡迪为该论文通讯作者，陆佳成、吴垒磊、孙怡宁、黄晓勇和高超为该论文的共同第一作者。

Lu Jia-Cheng,Wu Lei-Lei,Sun Yi-Ning et al. Macro CD5L deteriorates CD8T cells exhaustion and impairs combination of Gemcitabine-Oxaliplatin-Lenvatinib-anti-PD1 therapy in intrahepatic cholangiocarcinoma.[J] .Nat Commun, 2024, 15: 621.