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血液单细胞免疫谱揭示干扰素-MAPK通路介导COVID-19的免疫应答

Blood single cell immune profiling reveals the interferon-MAPK pathway
mediated adaptive immune response for COVID-19

杂志：medRxiv preprint

单位：四川省人民医院

日期：2020.3.17

摘要：

作者使用单细胞测序对5'mRNA、TCR和BCR V(D)J进行转录组分析，以揭示血细胞免疫反应特征。从16个参与者中共获得134620 个PBMCs、83387 TCR克隆、12,601 BCR克隆，聚类得到了56个细胞群和23个新的细胞标记基因。与对照组相比，患者的免疫细胞的特定亚型数量发生显著变化。干扰素-MAPK通路的激活是主要的防御机制，但MAPK转录信号在治愈的患者中被抑制。TCR和BCR V(D)J重组在产生不同抗SARS-CoV-2抗体方面差异很大。因此，干扰素-MAPK通路和TCR和BCR产生的抗体在COVID-19免疫反应中起着重要的作用。免疫缺陷或免疫过度反应可能导致COVID-19患者的病情加重。

研究背景：

COVID-19是正在出现的全球卫生问题，对我们的生命与财产造成极大的损失。科学家们也正在竭力研究该病毒，但目前来看其发病机制还不是完全清楚。人类免疫细胞及免疫分子在对抗病毒感染时起着关键作用，因此作者企图通过研究血液单细胞表达谱和免疫谱了解介导SARS-CoV-2免疫应答的机制。

研究思路：

主要结果：

1. 在PBMCs中鉴定出17种细胞类型

从四川省招募了16个志愿者，患病状态如下表所示。

从每个个体的全血中分离PBMCs。将所有样本的PBMCs进行10X单细胞表达谱和免疫谱测序分析，共获得134620 个PBMCs、83387 TCR克隆、12,601 BCR克隆。聚类得到56个细胞群，鉴定出17种细胞类型，包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD1C+_B 树突细胞等。

图1 COVID-19患者和对照组体内PBMCs的细胞组成

2. COVID-19患者和对照组的细胞差异比较

 （1）细胞比例

8个COVID-19患者与3个正常个体比较，发现CD1C+_B 树突细胞 、CD8 细胞毒性T细胞, 浆细胞样树突细胞的比例增加，B细胞和CD4辅助性T细胞比例减少。

分别将危重、严重、中度、治愈的COVID-19患者与正常个体比较，发现危重患者的56个细胞群中有40个比例减少，另外CD8+ T细胞, CD4+ T 细胞，浆细胞样树突细胞消失，这些变化显示危重患者可能存在免疫缺陷。而在严重患者中，56个细胞群中有45个比例增加，说明可能存在免疫细胞过度应答。在中度患者中，各种细胞类型的比例在危重与严重患者之间。在治愈患者中，效应CD8记忆性 T细胞(Tem), 巨核祖细胞, CD1C+_B树突细胞,  CD141+CLEC9A+树突细胞明显减少。

（2）差异基因与通路分析

   将危重、严重、中度、治愈的COVID-19患者分别与正常个体比较，筛选每种细胞亚型的差异基因，并对差异基因做通路富集分析，结果显示显著富集的信号通路主要有病毒mRNA翻译，α/β相互作用信号，MAPK通路, 淋巴细胞与非淋巴细胞的免疫互作,

MHC II 蛋白复合体，说明针对这个病毒的抗原呈递被激活。

   在严重患者中，超过一半以上的细胞类型中18个信号通路明显被富集，重要的一个就是干扰素信号通路的过度激活，包括2’-5’-oligoadenylate synthase，type I interferon signaling pathway，interferon alpha/beta/gamma signaling。在其他患者中，干扰素信号也都有不同程度的激活。在治愈患者中，干扰素信号激活不明显，而病毒mRNA翻译是被抑制的，MAPK信号通路明显富集。另外，为了确认这些变化的信号通路是否对SARS-CoV-2有特异性，还分别比较了COVID-19患者与甲流患者、急性咽炎患者、脑梗患者，结果显示仍旧是以上通路被明显富集。总体来看，干扰素-MAPK信号通路是响应SARS-CoV-2感染的主要免疫反应通路。另外，通过比较患者与正常个体，发现干扰素信号基因显著上调，比如IFI27，IFITM1, IFITM3,IFI6。以上结果说明干扰素信号，特别是干扰素α/β/γ和I型干扰素在COVID-19患者体内明显激活。

   在干扰素信号的下游，发现MAPK信号通路转录因子--- FOS, JUN, JUNB,  DUSP1在危重、严重和重度患者中被激活，而在治愈患者中却相反。说明MAPK信号通路在治愈患者中是被抑制的，这可能代表了一种病人要恢复的信号。

图2 干扰素-MAPK是响应COVID-19感染的主要免疫反应通路

3. 病人TCR/BCR抗体克隆检测

    在16个个体共检测到83387个TCR克隆和12601个BCR克隆，TCR克隆在危重病人中最少（1232），严重病人中多一些（7161），中度病人中最多（20370），以上结果显示病情越严重，TCR克隆越少。对数量排名靠前的一些TCR抗体序列进行进化保守性分析，发现CASSEGVGTPFDEQFF (patient 2，严重), CASSLGLAGDLDEQFF 和

CASNQGLAGGRLYNEQFF (patient 4，中度), CASSQERGVYNEQFF (patient 6，中度)，

CASSEVWASDHEQYF (patient 10，治愈)TCRα序列非常接近，说明这些抗体序列对SARS-CoV-2有特定的活性。与TCR相比，BCR克隆数量非常少，说明在患者中BCR抗体没有被强烈诱导。

   通过将数量排名靠前的一些TCR序列与已知抗原数据库比对，在COVID-19患者中，可以比对到EBV、HIV-1、influenza A、yellow fever、CMV等已知的RNA或DNA病毒。而在正常对照个体中，很少能监测到已知的病毒抗原。说明人类可能利用已知的免疫识别去抵抗COVID-19。

图3 COVID-19患者中TCR、BCR V(D)J克隆表达

4. RT-PCR验证干扰素-MAPK通路基因集的表达

   对前面检测到的被激活的干扰素-MAPK通路基因--IRF27, BST2, FOS进行验证，检测3个危重、3个严重、19个重度、3个轻症、10个治愈患者和5个正常对照的表达量，IFI27在所有患者中表达均明显上调。FOS在患者中表达上调，但在治愈患者中表达下调，因此可以将FOS作为患者治愈的潜在MARKER。另外，还通过免疫荧光检测了IFI27的蛋白水平，发现在所有患者中均高表达，而只在部分正常对照个体中有表达。

图4 干扰素-MAPK信号通路响应SARS-CoV-2感染的机制

结论：

通过呼吸系统感染SARS-CoV-2，病毒进入循环系统，导致血液免疫反应。参与免疫反应的细胞类型有很多，包括CD8+ T 细胞, CD8 cytotoxic T 细胞, CD4+ T 细胞, CD4+ cytotoxic T 细胞,CD1C+_B 树突细胞等。病毒到达免疫细胞后，可能主要是在AXL+SIGLEC6+ 树突细胞, CD4+ T细胞, naive CD8+ T细胞复制，从而激活多种细胞中的干扰素信号通路，产生效应因子-- IFI27, IFITM1，IFITM3来对抗病毒。紧接着MAPK信号通路的转录因子-- FOS, JUN, JUNB被激活，然后转录因子再激活下游MAPK信号通路，以此来抵抗病毒。