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文献解读 | 人类心脏发育的空间基因表达和细胞图谱
发布日期：2020-03-06浏览：
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近期，由于疫情的原因大家都宅在家里，我们准备了一篇关于人类心脏发育的空间基因表达和细胞图谱的文献供大家阅读。
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人类心脏发育的
空间基因表达和细胞图谱
A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart
IF：36.216 cell 日期：2019.11 单位：瑞典皇家理工学院
人类心脏形态发生的过程还不完全清楚，若要充分了解需要在单细胞空间分辨率的基础上深入探索心脏内基因的表达。本文作者提出一种方法，可以展示在三个发育时期胚胎心脏（图1）全面的细胞类型转录表达谱，并将细胞类型特异性基因映射到特定的解剖区域。空间转录组学鉴定了独特的基因表达谱，对应于每个发育阶段的不同解剖区域。单细胞RNA测序鉴定的人胚胎心脏细胞类型，证实并丰富了胚胎心脏基因表达的空间注释。然后通过原位测序去完善这些结果，并为三个发育时期创建了一个空间亚细胞图谱。最后，作者提供了一个可公开使用的人类心脏发育网络资源，以促进未来对人类心脏发育的研究。
研究思路：
主要结果：
1、 人类心脏发育期间时空基因表达动态
分别对4.5-5、6.5、9孕周（PCW）的胚胎心脏组织进行免疫组化染色（IHC）（图2a,b,c），显示心肌肌钙蛋白（TNNT2）在三个孕周时期的左右心室与心房游离壁和隔膜均表达。主动脉平滑肌肌动蛋白（ACTA2）在流出道（OFT）表达，显示主动脉和肺动脉在4.5–5孕周已经开始形成，在后面两个孕周逐渐增大。在房室外膜下间质内的冠状动脉以及纵隔组织内的肺静脉中也有ACTA2的表达，但都只在后两个孕周可见。
作者收集4.5–5、6.5、9 孕周胚胎心脏组织沿背腹轴做切片（图3），进行空间转录组测序（ST），共获得3115个spots。对三个孕周的数据合并分析，降维聚类得到10个cluster，并鉴定细胞类型（图2d）。然后再将所有的spots映射到每个组织切片的坐标位置（图2e,f,g）。结果发现主要心肌区域（clusters 0, 1, 2, 3, 4）随孕周的增大spots数量也在增加，反映了心脏的生长。在4.5-5孕周看不到流出道（OFT）和大血管（cluster5），主要是房室（AV）间质（cluster6）。对每个cluster做了差异基因分析和上调基因的GO富集（图2h），显示每个cluster之间既有相同的功能，比如clusters (0, 1, 2, 3, 4)都与心脏的收缩与发育相关；也有特定的功能，比如cluster0主要在新陈代谢内富集，cluster1,2在传导和cluster3在氧化代谢富集，cluster4在内分泌活性、传导、心率调节富集。
图2：三个心脏发育时期的整体时空分析
图3：三个发育时期的组织切片展示
2、 6.5-7孕周人类胚胎心脏的单细胞表达分析
由于空间转录组无法达到单细胞分辨率，为了使结果更准确，作者对6.5孕周的心脏组织做了10X单细胞测序（scRNA-seq）。将心脏组织切开，分成两块（图4c）：一块包括流出道、房室结构和心房的大部分，另一块包括心室。然后分别进行单细胞测序，共获得3717个高质量细胞。降维聚类分成15个cluster（图4b），基于marker鉴定细胞类型，包括3种心肌细胞类型、心脏神经嵴细胞、施旺祖细胞、心外膜细胞、EPDC、2种内皮细胞、4种成纤维样细胞。另外，作者对6.5孕周的空间转录组和单细胞测序结果进行相关性分析（图4a），显示皮尔逊相关系数r=0.93，说明两个样本的生物学重复性较好。
图4：6.5-7孕周人类胚胎心脏的单细胞分析
3、构建一个心脏发育的细胞基因表达图谱
为了进一步完善数据结果，作者对三个孕周的心脏组织还做了原位测序（ISS），首先设计包含69个基因的panel，一些基因是来自ST的marker，另一些来自scRNA-seq中每个cluster的marker（免疫细胞除外），还有一些先前报道的对心脏发育很重要的基因。最后根据ISS、ST、scRNA-seq结果，利用算法构建一个完整的6.5孕周胚胎心脏的空间细胞图谱。除了空间定位外，细胞映射算法还可以将scRNA-seq中的reads比对到每个细胞（图5a,c,e）。该空间图谱由20920个单细胞组成（图5b,d），它不仅验证了ST结果中cluster的分布，还解决了彼此紧密相邻的不同细胞类型形成的精细结构。
图5：6.5孕周的人类心脏发育的细胞类型图谱
4、通过空间分析解析细胞类型的相似性
作者展示了ISS、ST、scRNA-seq三种技术得到的结果一致性，对3种细胞亚型（心肌神经嵴细胞、施旺祖细胞、心外膜细胞）的marker基因进行检测（图6a,b），显示心肌神经嵴细胞marker只在早期表达，施旺祖细胞marker只在晚期表达（图6c,d）。另外，在房室外膜下间质内心肌神经嵴细胞不存在，施旺祖细胞只在其发育后期存在（图6e,f）。
图6：三个心脏发育时期的靶向时空分析
结论：
通过单细胞时空测序方法研究人类心脏发育过程，构建了一种分子方法可用于以后研究其他物种器官发育。本文方法可以探索组织内整体的空间转录模式，解析细胞异质性，选择性地研究关键靶基因的空间表达模式。这也是首次在单细胞空间分辨率上研究人类器官发育的转录图谱（图7）。另外还提供了网络资源，用于研究和查看人类心脏发育时空基因表达模式。
图7：3D基因表达图谱
2、 6.5-7孕周人类胚胎心脏的单细胞表达分析
由于空间转录组无法达到单细胞分辨率，为了使结果更准确，作者对6.5孕周的心脏组织做了10X单细胞测序（scRNA-seq）。将心脏组织切开，分成两块（图4c）：一块包括流出道、房室结构和心房的大部分，另一块包括心室。然后分别进行单细胞测序，共获得3717个高质量细胞。降维聚类分成15个cluster（图4b），基于marker鉴定细胞类型，包括3种心肌细胞类型、心脏神经嵴细胞、施旺祖细胞、心外膜细胞、EPDC、2种内皮细胞、4种成纤维样细胞。另外，作者对6.5孕周的空间转录组和单细胞测序结果进行相关性分析（图4a），显示皮尔逊相关系数r=0.93，说明两个样本的生物学重复性较好。
2、 6.5-7孕周人类胚胎心脏的单细胞表达分析
由于空间转录组无法达到单细胞分辨率，为了使结果更准确，作者对6.5孕周的心脏组织做了10X单细胞测序（scRNA-seq）。将心脏组织切开，分成两块（图4c）：一块包括流出道、房室结构和心房的大部分，另一块包括心室。然后分别进行单细胞测序，共获得3717个高质量细胞。降维聚类分成15个cluster（图4b），基于marker鉴定细胞类型，包括3种心肌细胞类型、心脏神经嵴细胞、施旺祖细胞、心外膜细胞、EPDC、2种内皮细胞、4种成纤维样细胞。另外，作者对6.5孕周的空间转录组和单细胞测序结果进行相关性分析（图4a），显示皮尔逊相关系数r=0.93，说明两个样本的生物学重复性较好。
2、 6.5-7孕周人类胚胎心脏的单细胞表达分析
由于空间转录组无法达到单细胞分辨率，为了使结果更准确，作者对6.5孕周的心脏组织做了10X单细胞测序（scRNA-seq）。将心脏组织切开，分成两块（图4c）：一块包括流出道、房室结构和心房的大部分，另一块包括心室。然后分别进行单细胞测序，共获得3717个高质量细胞。降维聚类分成15个cluster（图4b），基于marker鉴定细胞类型，包括3种心肌细胞类型、心脏神经嵴细胞、施旺祖细胞、心外膜细胞、EPDC、2种内皮细胞、4种成纤维样细胞。另外，作者对6.5孕周的空间转录组和单细胞测序结果进行相关性分析（图4a），显示皮尔逊相关系数r=0.93，说明两个样本的生物学重复性较好。
2、 6.5-7孕周人类胚胎心脏的单细胞表达分析
由于空间转录组无法达到单细胞分辨率，为了使结果更准确，作者对6.5孕周的心脏组织做了10X单细胞测序（scRNA-seq）。将心脏组织切开，分成两块（图4c）：一块包括流出道、房室结构和心房的大部分，另一块包括心室。然后分别进行单细胞测序，共获得3717个高质量细胞。降维聚类分成15个cluster（图4b），基于marker鉴定细胞类型，包括3种心肌细胞类型、心脏神经嵴细胞、施旺祖细胞、心外膜细胞、EPDC、2种内皮细胞、4种成纤维样细胞。另外，作者对6.5孕周的空间转录组和单细胞测序结果进行相关性分析（图4a），显示皮尔逊相关系数r=0.93，说明两个样本的生物学重复性较好。
2、 6.5-7孕周人类胚胎心脏的单细胞表达分析
由于空间转录组无法达到单细胞分辨率，为了使结果更准确，作者对6.5孕周的心脏组织做了10X单细胞测序（scRNA-seq）。将心脏组织切开，分成两块（图4c）：一块包括流出道、房室结构和心房的大部分，另一块包括心室。然后分别进行单细胞测序，共获得3717个高质量细胞。降维聚类分成15个cluster（图4b），基于marker鉴定细胞类型，包括3种心肌细胞类型、心脏神经嵴细胞、施旺祖细胞、心外膜细胞、EPDC、2种内皮细胞、4种成纤维样细胞。另外，作者对6.5孕周的空间转录组和单细胞测序结果进行相关性分析（图4a），显示皮尔逊相关系数r=0.93，说明两个样本的生物学重复性较好。
