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互动问答|空间转录组测序技术研讨会
发布日期：2021-07-02浏览：
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由dafabet手机黄金版联合10x Genomics共同发起的3月25日“空间转录组测序技术网络研讨会”已经结束啦，感谢大家的支持，本次会议取得了圆满成功，共计2500+的观看量！
由于现场弹幕提问太多，现场来不及一一互动。小编将提问的问题整理了一下，分两期为大家解答！想要观看直播回放的老师也可以扫描下方二维码观看回放！
用空间转录组找出前列腺癌代谢空间模型的选择性脆弱点
Q：文章讨论的是肿瘤组织中的代谢，但目前文章是根据RNA表达数据来写的，未来是否有可能把空间蛋白组学、空间代谢组学的内容一起整合起来，进行综合分析？
A：是有可能的。10x Genomics公司已开发的把单细胞RNA表达测序与单细胞蛋白检测结合起来的方法，名字叫“TotalSeq”。这种方法可以检测到单细胞的全部RNA和被标记抗体识别的蛋白表达量。
并且10x Genomics公司还在开发新的把多组学整合在一起的实验方法，我们期待新方法的出现。
Q:用空间转录组来预测前列腺癌的代谢脆弱性很有趣，能否预测一下，未来这个技术还会有什么其它的应用？
A：对这个技术的预估，一方面可以把它用在别的肿瘤的代谢脆弱性的检测，或许能发现新的治疗方案。
还可以考虑把这种方法用在畜牧业上，看如何能让猪牛羊鸡鸭的代谢细胞，发现限制这些动物更快地长肉、更多地产奶的限制因素，通过去除限制性因素，得到更加高产的养殖方法、或者是更加高产的动物种系。
Q:贵公司目前有没有做过病毒感染后组织的空间转录组学变化，以及结合单细胞测序分析，或者有没有相关文献？
A：我司的客户有发表过用空间转录组分析病毒感染后组织的的文章，如《COVID-19 immune features revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas》，就是讨论新冠病毒的，并且用到了单细胞测序技术。别的可能有在进行的、但还没有发表文章的，dafabet黄金手机版方面不方便透露，这也是dafabet黄金手机版为所有的客户应尽的保密义务。
国际上有讨论病毒感染后空间转录组变化的文章，举例说明：《Exuberant fibroblast activity compromises lung function via ADAMTS4》这篇文章，就是讨论流行性感冒的，其中用到了空间转录组、和单细胞测序的方法。
10x空间转录组项目流程及案例分享
Q:空间转录组一个spot可以捕获几个细胞？一个样本能不能同时做单细胞和空转呢？目前空间转录组的分辨率有多高？
A：目前空间基因表达芯片的捕获区域是6.5×6.5mm，一个spot的直径是55μm，大概捕获1-10个细胞。一个样本可以同时做单细胞和空转，前提是二者的各项质控标准必须达标。且单细胞的样本区域和空转切片的组织区域尽量越靠近越好。
Q：空间转录组的建议测序量是多少？
A：单个spot建议测序50kreads
Q:骨或软骨组织可以做吗？
A:目前骨和软骨的项目经验正在摸索当中，只要切片制片和RNA质控符合标准都可以进行尝试。
Q:比较小的组织，如何拼凑在一张片子？
前期样本包埋时可将几个较小的组织包埋在一起，注意包埋方向和切片方向的一致性。切片时即可获得多个样本的截面，并用多样本的混合截面进行玻片制备。
Q :你好，请问在做组织透化的时候，7个spot需要7个组织切片吗，还是同一个组织切片就可以做7次不同的时间的透化？
A :组织透化时，7个spot需要7个组织切片，分别做阴性对照和对应6个时间梯度。
Q:空间转录组得质控不是很难把控吗？一个是病理上要找病理学家看，到底能不能用。然后一个spot里面有多个细胞，那么这个质控应该是要跟单细胞质控一样还是要宽松一点？
A :空间转录组质控主要看RNA的完整性和切片的免疫染色情况，原则上客户本身对样本的病理情况要有一定了解。一个spot里面的细胞数可能为1-10个，spaceranger的数据标准基本与单细胞的cellranger一致。
Q:是1个样本1张芯片吗？
A:一张组织透化芯片对应一个样本，需要放置同一样本的7张切片；一张空间基因表达芯片上面有四个捕获区域，一个捕获区域放置一个样本即可，即一张空间基因表达芯片可对应4个样本。
空间基因表达芯片
组织透化透化芯片
Q:可以做皮肤的空间转录测序吗？
A:目前我们公司已有十余项皮肤空间转录组的项目经验。
Q:空间转录组测序组织切片的选择有什么依据么？选择不同的切片是否会对结果产生很大的差异？
A:一般来说切片的选择是根据HE染色的结果来判断的，除了查看切片制备质量，也要观察切片是否为目标区域。若组织的异质性极大，不同的切片可能会有些许差异。对于结果的影响可能在于细胞类型上，以及细胞类型对应的细胞数量上。
空间与单细胞表达数据分析的区别及整合
Q:请问选取30个PCA做下游分析的理论依据主要有哪些？谢谢！
A:PCA不仅能达到降维目的，保留基因空间内的细胞表达相似性距离（也就是在基因空间内细胞间距离约等于PCA空间的细胞间距离），另外达到将低噪音目的（由于比如0膨胀等表达值测量误差随机因素）。根据主成分特征值排序选取多少个PCA？根据每个数据集的具体情况可以选取不一样，ElbowPlot是简单常用的选取方法，根据主成分解释的方差从大到小排序，遇到曲线下降减缓的点即为选取的PCA个数，它人为后面的PCA主成分无法解释数据集的方差即为噪音。由于每个单细胞数据集的细胞类型组成以及差异程度都不太一样，选取30个是个平均化的经验性参考值。更加合理的情况是同时选取多个PCA，观察下游细胞类型定义结果的好坏来确定这个值。
Q:何老师您好，对于多个样本的单细胞数据，是先筛选variable基因再进行整合，还是整合后再筛选variable基因比较合理？谢谢老师
A:关于单细胞多样本整合分析，首先对单个样本筛选高变化基因集，然后混合多个样本的高变化基因集（可以采用Seurat方法来确定多个样本的高变化基因），对于筛选到高变化基因集后进行纠正样本间的批次效应即整合，然后进行下游PCA，聚类和UMAP分析。总之，先筛选后整合是合理的。
Q :您好老师，请问多套单细胞数据整合时候，你感觉对于10X数据应该保留多少个基因进行整合
A :关于单细胞多样本整合分析的高变化基因选取问题，通常应选到每个单细胞样本的高变化基因，然后再混合所有的高变化基因（可以采用Seurat方法来确定多个样本的高变化基因），一般选取2000或3000个间，更加合理的情况是同时选取多组基因，观察下游细胞类型定义结果的好坏来确定这个值。
Q:如果样本本身不呈现细胞类型的空间严格地区域化分布，比较离散，是不是不应该采用空间聚类方法？
A:空间聚类分析结果通常呈现聚类结果空间区域化的特点，如果样本的同一细胞类型出现离散，并与其余细胞类型共定位，建议不采用空间聚类方法，而使用不考虑空间维度的Seurat Louvian聚类方法。
Q:请问，通过调整resolution参数，可以改变聚类图的形状吗？如何优化美化不美观的tsne图呢？
A:第一个问题：调整resolution参数，不可以改变tSNE/UMAP的坐标，但可改变每个细胞的数字标签。
第二个问题：首先要了解样本的细胞类型组成和差异程度，如果细胞类型差异程度很大（比如T和B），选取2000个高变化基因+30个PCA的tSNE图是很容易区分的，如果细胞类型差异程度很小（比如T细胞亚型），则需要调节高变化基因和PCA数，根据细胞类型定义结果选取最佳的tSNE图。另外，可以参考发表的类似组织和样本的单细胞文章中的tSNE图和设定的参数值，还需要注意数据质量。
Q :请问单细胞与空转联合分析一定需要一样么？比如我做2组，3样/组的单细胞，空转也需要对应这样么？那我做出来需要每个样都做空间分布么？还是只需要每组只做一个空转样本，然后做空间分布就好了？
A:单细胞与空间表达数据的整合分析有如下条件，单细胞需包含高质量细胞类型注释，且与空间样本包含共同的细胞类型组成，因此最佳情况是相同样本，这样可满足上面的条件，但如果只有空转样本无单细胞样本，可以从公共数据集中下载类似空转样本的单细胞数据集（包含预期的细胞类型）。
对于实验设计是分为2组，每组3个样本的单细胞，以上的情况如果想了解下每组细胞类型在空间样本定位的话，则需要每组一个空转样本，总共2个，这样可比较这两个空转样本细胞类型定位分布的差异。如果想了解组内差异的话，则需要每组与单细胞对应的3个空转样本，总共6个，这样可以组间细胞类型定位分布的差异更有统计意义，此外还可以了解组内样本的差异。对于单细胞与空间表达数据的整合分析，可使用同一套单细胞数据集，即为6个样本的混合。
