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文章概要

研究背景

实验结果分析

实验内容的第一部分，在发育时间和空间上对101种肠细胞类型进行分类

作者取了77个胚胎的肠道样本，这些样本是从怀孕8周到22周的胎龄。

这些样本，涵盖了隐窝形成之前的时间点，直到类似成人状的绒毛/隐窝形成的发育，

在做测序文库的过程中，作者用了带寡核苷酸标记的抗体，

最后，是得到了包含76,592个细胞的数据集

聚类分析，把这7万多个细胞分成了9个细胞簇。

分析过程中，主要是根据转录的特征基因来注释这些细胞

这两张图，是在UMAP图上，用颜色把细胞在空间和时间上的分布画出来

左边的图是细胞在空间上的分布，右边的图是细胞在时间上的分布

再进一步，用关键标志基因进一步把细胞分成101个亚细胞群。

图中这些亚细胞群之间的连线的粗细，表示这些细胞之间的关系的紧密程度。

作者做了转录因子调控网络的映射，以突出显示每种细胞类型的关键调控网络，并重新创建决定细胞命运的“决策树”

图中就是这个决策树。

这是101个亚细胞群的配体—受体相互作用图

实验内容的第二部分，单细胞的空间位置

对整个肠道组织的发育做空间转录组。

每张切片中的spot，都可以被归类成5到13个spot簇。

空间转录组中，特定细胞与特定基因出现在合适的位置

例如隐窝顶部结肠细胞和成肌纤维细胞出现在它们应该在的解剖位置。

RET基因出现在肌间神经丛

PTPRC基因出现在粘膜下淋巴滤泡中

确定了2893个与深度相关的基因，纵轴排列的就这是基因

中间白色的分隔，白色分隔左边的是肌层粘膜，它的距离分数是正的

右边的是粘膜下的位置，它的距离分数是负的.

可以看到不同的深度位置有不同的基因表达，从浅到深，表达的基因从肌肉、神经，逐渐向吸收性腔功能变化

这分别是怀孕12周、19周、和成年的肠组织中沿深度分布的细胞种类图，对应到空间转录组

实验内容的第三部分，人肠上皮发育

作者的数据集中，捕获到了17,622个上皮细胞。

左边是这1万7千多个细胞组成的UMAP图，右边是按照这些细胞所处的位置，与根据怀孕的时间长度标注的UMAP图。

这些细胞在吸收性、分泌性、未分化性、和干细胞性上，容易区分。

近端与远端的样本的细胞表达，有很大的差异。

这表现在CCL25和APOE这样的高度特异的基因表达。

也通过拟时序图的细胞轨迹分析，和RNA速率分析得以确定。

随着时间的推移，观察到了上皮细胞的实质性细胞重塑。

在怀孕12周之前，祖细胞和TA细胞占主导地位，几乎没有成熟的吸收性细胞和分泌性细胞

在12周之后，上皮的成分已经与成年组织相似

实验内容的第四部分，上皮干细胞（ISC）的发展起源

观察到近端和远端的上皮干细胞都随时间逐渐增加，

例如：LEFTY1基因是远端的转录调控基因，FOXD1是近端的转录调控基因

从这两个基因的表达上，都可以看到随着时间的推移，表达逐步增加。

GATA4，是一个内胚层的调节因子，它只在小肠中表达

可以看到12周之后，它的表达大幅消失，

到第22周周时，就几乎看不到它的表达了。

转铁蛋白（Transferrin）在上皮细胞中高度表达，这证实了铁代谢在绒毛形成的重要性

LGR5是一个特征明确的上皮干细胞基因。

在妊娠早期，也就是怀孕12周之前，在类似干细胞的祖细胞中弥散的方式被检测到。

后来定位于隐窝的基底部

与LGR5的表达相对应，ASCL2的表达，随着发育的时间而增加。

我们可以从图片中看到，时间越到后面，UMAP图上，着色的点越多，颜色也越深

实验内容的第五部分，专门的神经上皮通路作为上皮干细胞（ISC）发育的序言

分泌细胞系在怀孕12周时出现，在第8～10周时检测到极少的杯状细胞。

12周后，杯状细胞和肠内分泌细胞逐渐增加

分泌细胞进一步细分成11个簇

RL映射建立了主要的肠内分泌信号传导通路。

在12周的结肠中发现，肠嗜铬细胞，它通过多种途径与抑制性运动神经元相互作用，包括TPH1-HTR2B，这是一种食欲和运动中的5-羟色胺信号传导途径。

BEST4/OTOP2细胞的发育与隐窝-绒毛通路脱钩

实验内容的第六部分，横跨各部分的协调发展

实验内容的第七部分，形成肠道血管生成

在内皮细胞中清楚地看到了转录特征对应于结构特征。

内皮细胞分化成静脉、动脉和淋巴管，并进一步按血管的大小区分开来。

在整个发育过程，作者观察到了从小血管到大血管的过渡，反映了肠道的血管生成过程。

可以看到，驱动血管分化的转录因子网络在各个细胞簇随时间的变化。

这里，上面的图是通过空间转录组的点的细胞类型预测的内皮细胞簇

下面的图，是从单细胞转录组数据得到到的大的静脉单细胞的特征。

ANGPT2是内皮细胞与周细胞RL相互作用的关键调节剂，已被证实位于胎儿的脉管系统。

分析细胞的细胞周期，发现在发育的早期，大多数细胞是高度循环复制的祖细胞

使用成纤维细胞，周细胞，肌细胞和肌成纤维细胞区室细胞的Monocle算法进行的轨迹分析突出显示了分别来自成纤维细胞祖细胞的S1和S3的周细胞和成肌纤维细胞的分化。

S1期由ADAMDEC1基因标记

S3期由OGN标记

实验内容的第八部分，肠神经系统和固有肌层

作者识别出早期的7个神经元簇和5个神经胶质细胞簇

祖细胞和分化的肠平滑肌细胞分别以PLPP2和ACTA2等基因标记

早期的肌细胞出现，以祖细胞群为主

内层与外层的肌细胞，主要在12周后大量出现

确定了描述肌细胞的关键转录因子网络。

KLF7是肌肉中是标志基因

TWIST2是间质细胞和外层肌细胞的标志基因。

实验内容的第九部分，发育中的固有层肠间质细胞

随着肠的发育，这些不同的区室由间充质细胞支持，间充质细胞是图谱中最大的组成部分。

在这个实验中，一共有24081个间充质细胞

根据时间、位置、和细胞周期的差异，把这些细胞分成16个亚细胞簇

S1细胞的3个簇形成了大部分的粘膜下结构细胞

而S2细胞（由F3，NPY和FOXL1标记）表达的标志物类似于隐窝性细胞群

类S3细胞不仅在子宫内构成主要的成纤维细胞群，而且还表现出更大的异质性

轨迹分析确定了一个分支点，其中未成熟的S3样细胞分为S3或S1 / 2/4谱系，可以通过谱系特定的TF网络（例如NR2F1）进行区分

实验内容的第十部分，映射到形态上的梯度指导肠道发育

这是形态发生子分子STRING相互作用组的图形可视化。

楕圆虚线突出显示了向8个信号通路富集的社区。

共表达分析，确定11种细胞类型特异、13种空间特异的模块

实验内容的第十一部分，S2成纤维细胞具有特定位置并能控制上皮形成

S2特异性基因形成了一个主要的粘膜下成纤维细胞形态发生模块（scRNA-seq模块2）的一部分，

该模块包含DLL1，BMP5和NRG1。

作者确认在隐窝形成之前存在S2标记F3，并且形成的小丘随着绒毛的形成而向上增加

实验内容的第十二部分，人类肠道免疫力的发展

找到了6个免疫谱系的细胞簇

在10周的时候，观察到了髓样细胞的富集

在12周的时候，有幼稚的CD4+和CD8+T细胞。

这是免疫细胞在空间出现的位置

实验内容的第十三部分，绘制先天性肠道疾病的细胞基础

为了揭示可能导致先天性肠道疾病的时间关键性转录缺陷，作者将数据与人表型本体论（HPO）的围生期肠道疾病的精选清单相关联，并注明了遗传表型

通过将749个已知的疾病基因与我们的scRNA-seq数据整合在一起，作者将先天性疾病与表型相关联，这些表型可能通过高度细胞类型特异的缺陷表现出来并导致肠道，腹，会阴，神经节，炎性或肿瘤病理疾病

从基因分析中，发现SPINT2、DGAT1基因的缺陷可能导致严重的先天性腹泻。

RET、SOX10基因与Hirschsprung病有关，Hirschsprung病是一种结肠不具有正常神经网络的先天性疾病，几乎没有排便的冲动，因此粪便积聚并引起巨结肠。

作者的数据，可以让作者根据时间的变化寻致疾病相关基因。

发可以现HMGA2基因与肠道旋转不良有关。

早期抑制运动神经元特异的NXN的致病突变可导致脐膨出。

总结