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10X单细胞表达数据的产生过程包括样本组织细胞解离成悬浮液，经过10X平台建库测序，一般每个样本有成千上万个单细胞进行数据分析。

ST则对组织空间中通过样本制备，组织切片，组织质控和优化等步骤对组织内多个非常微小区域进行采样，从保留了细胞在组织中的空间坐标信息，结合表达数据进行数据分析

我们使用公共数据集小鼠脑区组织的单细胞和ST的示例数据来讲解上面的两种整合分析策略。

2万多个单细胞数据显示脑区组织有23种已知的细胞类型，这里以不同记号表示。

比如细胞量最大的细胞类型标记为L5 IT，中文全称为脑区新皮层层状结构第5层IT细胞，IT表示端脑内侧束。

这个细胞类型在柱状图中对应于最高的一跟柱子，在tSNE图中对应中间的一个区域，其余细胞类型不在一一列举，大家可以在课后类似的对应查找和了解

组织ST的一张芯片上总共有4992个Spots，78行，128列，Spot在列中交替排列

此示例数据中产生有效2696个Spot，黄色点显示，聚类分析产生18个簇，这些聚类簇的细胞类型是未知的，这里以数字编号显示。

目前整合分析达到的一个目的是利用single cell RNA的细胞注释信息预测ST-Spot的细胞类型

ST的Spot直径大约有55uM，根据不同组织样本的特点，我们一般认为在空间位置邻近的属于同一种细胞类型，因此一个Spot内的细胞类型是同质的，当然不能排除不同细胞类型区域的交接区域内Spot是异质

两个分析方法，第一个针对Spot-Level，比如Seurat-Label-Transfer 和 Deconvolution反卷积方法，后面这个方法也许在未来的课程中讲解

第二个针对Spot-Cluster水平的MIA方法。

整体步骤如下，单细胞高变基因表达数据进行PCA降维，将ST的Spot投射到PCA空间上，搜索和过滤双向近邻对，Seurat中有个术语叫做Anchor，如何定义双向近邻后面会以图示讲解

最后对ST的Spot进行细胞类型概率值预测，总和为一，也可近似理解为每个Spot的细胞类型比例。
 

第一步PCA分析是高维的基因空间降低到低维的PCA空间，比较形象点来说是从成千上万的变数中抓住主要矛盾

我们也可以从几何直观上去了解它，本质上它是在寻找数据变化程度最大的维度方向，而且这些方向在高维空间是正交垂直的

有一点我想特别说明下，PCA是一种线性降维，因此有显式的计算公式，如果新样本数据一来，带入公式可以将这些数据点投射到已知的PCA空间上，这样的操作可以起到不同数据Coembedding整合在同一个空间上去。
 

第二步Mutual Nearest Neighbor 双向最近邻方法，分为四步，第一步 搜索Anchors

在PCA空间上找一些双向邻居对，蓝色点表示单细胞，红色点表示Spot，在PCA空间中从这个单细胞出发搜索ST中K个邻居Spots，比如这里参数K设置5个，反过来从Spot出发去搜索单细胞数据中K个邻居单细胞，如果是双向邻居则定义为一个Anchor，这样在我们的数据集会找到很多Anchors

第二步过滤不可靠Anchor，在过滤阶段要求放宽，不是互邻居，只满足单邻居就可以

第三步，确定较可靠的双向邻居对

第四步，量化这些邻居对的可靠程度，采用是共享邻居的比例

我们可以看到前2个步骤K的选取一般为5, 200，这两个参数可控制Anchor数。

接下去我们自然想看下这些Anchors在tSNE图上的哪些位置以及已知细胞类型的注释信息

由于存在平台效应，从tSNE图上看单细胞和ST数据集是分离的，也是意料之中

第二个图我们可以看到这些Anchor对，红点表示ST，蓝点表示单细胞，绿色连线表示Anchor对，单细胞中有许多Anchor对成员散落于不同细胞类型注释中

那么我们可以看到各自的细胞注释比例情况。

如果我们把这些Anchors投射到ST空间切片图上，可以看到空间上许多五颜六色的点表示不同细胞类型注释的Spot，而灰色表示不是Anchor和没有注释的Spot，也是我们想要去预测的Spot，如果在tSNE图上，我们看到是这样子的。
 

最后一个步骤是预测Spot的细胞类型，因为有一组Anchors，每个Anchor有已知细胞类型，假定有个待预测的Spot，我们可以算出这个Spot归属于每个Anchor的概率，按照细胞类型为单位累加则是这个Spot属于每个细胞类型的概率值，加和等于1，这个是详细的计算步骤。

好，有了前面介绍整个步骤的想法，那么我们如何去实现？Seurat提供了2个封装好的函数，重要的是了解下输入参数的意义，第一个是FindTransferAnchors函数，参数较多，按照不同性质划分为3组参数分别讲解，第二个是TransferData函数

黑色方框是FindTransferAnchors的命令， 红色显示参数名称

第一组参数命名为Seurat对象

reference表示single cell RNA数据集的Seurat对象

query表示ST数据集的Seurat对象

reference.assay表示single cell RNA数据集的Seurat对象中分析子对象RNA，这个RNA记号是可自定义的

query.assay表示ST数据集的Seurat对象分析子对象Spatial，这个Spatial记号也可自定义

normalization.method表示标准化方法，一般为log2normalization

第二组参数命名为基因特征

features表示single cell RNA的PCA分析中使用的基因特征集

max.features表示过滤anchor时每个PCA对应的最多基因特征数

第三组参数命名为Anchor K值

k.anchor表示PCA空间中搜索Anchor的近邻K值

K.filter表示基因特征空间中过滤Anchor的近邻K值

k.score表示anchor score使用的近邻K值

在这里我还是强调下2个参数k.anchor用于搜索Anchors，如果这个值越高anchors数越多，而k.filter用于过滤Anchors，如果这个值越高，则保留的anchors越多。
 

第二个是TransferData函数，以黑色方框显示，红色显示参数名称

anchors表示前面的FindTransferAnchors得到的anchors对象；

refdata表示single cell RNA数据集中细胞编号对应的细胞类型；

prediction.assay表示是否进行细胞类型预测；

weight.reduction表示ST数据中用于Spot与anchors的距离计算时的PCA空间；

k.weight表示计算Spot与Anchor权重向量时的近邻K值。

最终我们得到Spot的细胞类型预测结果文件，行为Spot编号，以Spot行序号 加星号 加Spot列序号 组合表示，列为细胞类型，指定一个Spot，如果某个细胞类型的概率值最大，即预测为此细胞类型

举例来说，第一行的Spot，预测为L5 IT的概率值达到0.96，在其余细胞类型中是最高的，因此这个Spot预测的细胞类型为L5 IT，我们可以在空间切片图上看到这个Spot的坐标位置

我们可以将上面的表格进行空间切片图的可视化，左边每个Spot用最大概率的细胞类型用不同颜色显示

右边每个子图是每个细胞类型下每个Spot的预测概率值的空间分布，可以直观看每个细胞类型在空间上的分布模式

比如这个是L5 IT这个细胞类型的空间分布。

MIA，多模态数据取交集方法，是针对Spot Cluster 水平上利用单细胞注释信息来对ST-Spot聚类结果进行细胞类型注释。

给定单细胞某个已知细胞类型和某个Spot的聚类编号，我们分别筛选各自的CellMarkers和SpotMarkers

Background定义为单细胞与ST数据共同表达的基因集，根据单细胞的CellMarkers可以将背景基因集分成两块区域，蓝色和黄色部分

然后将ST的SpotMarkers分别与这两个区域取交集

如果这个ST的SpotMarkers是随机抽取的，那么落在这两个区域的基因数应该是符合一定的比例， 如果出现过度集中与蓝色区域，则我们认为CellMarkers与SpotMarkers是显著重叠的，那么我们可以得到这个SpotCluster属于这个细胞类型的可能性越高。

其实这个就是超几何分布模型，我们可以一个公式来计算显著性P值，由于P值是0-1之间，很小的数，我们可以取-log10，转换为得分，此得分越高，注释与这个细胞类型的可能性就越高。

很简单，我们可以在R中的基本函数phyper中实现，命令用黑色方框显示。

i表示同时属于scRNA的CellMarkers和ST的SpotMarkers

M表示scRNA的CellMarkers

大N表示scRNA和ST同时表达基因

小n表示ST的SpotMarkers

在这里我想说个题外话，这个模型简单且非常实用， 在基因功能富积分析使用的模型就是这个，所以课后不妨大家多多了解下
 

最终我们得到SpotCluster的细胞类型预测结果文件，行为Cluster编号，其中括号内的数字表示ST的SpotMarker数，列为细胞类型

如果得分越高，这个SpotCluster属于这个细胞类型的可能性就越高，我们可以看到Cluster3属于Oligo的得分最高，因此属于这个细胞类型的可能性就最高。
 

我们可以将上面的表格进行热图展示，行为Cluster，列为细胞类型，对细胞类型做了层级聚类

我们可以看到红色方框内是Cluster3对应的Oligo细胞类型的数值，由于此值在Cluster3对应的所有细胞类型最高，因此此Cluster被预测为Oligo细胞类型

我们也可以用桑基图展示Cluster与已知细胞类型对应关系，比如Cluster3沿着这个弧线对应到Oligo细胞类型。
 

另外类似地，进行空间切片图的可视化，观察细胞类型在空间上的分布模式，我们可以看到Cluster3和对应的Oligo这个细胞类型的空间分布。

共有两要点，第一个要点 Label Transfer和MIA方法的使用需要满足两个条件

第一个必须有准确细胞类型注释的单细胞数据

第二个single cell RNA和ST相同或相近样本保证共同的细胞类型组成，

第二个要点，Label Transfer是基于双向最近邻的Spot-Level水平的细胞类型注释，无需提前对ST数据进行聚类, 如果对前面讲的整个过程还是感觉稀里糊涂的话，一句通俗的话来概括就是ST数据最开始对所有Spot标记细胞类型未知的情况下，给部分Spot贴上标记，最后到全部Spot贴上标记。

而MIA是基于ST数据的聚类结果，在Spot-Cluster水平的细胞类型注释，因此它们两个分辨率是不同的。