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上课笔记|LIBRA-seq：快速高效制备单克隆抗体
发布日期：2020-07-27浏览：
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LIBRA-seq是Ian Setliff等科学家开发出的一种全新的制备单克隆抗体的方法。
这个方法的优点是：
1.速度快。一般一周时间就可以得到抗体基因序列。
2.适应性广。可以适用于各种细胞悬液，抗性B细胞的来源不再限于免疫后的小鼠的脾细胞。
3.可一次针对多种抗原。可一次实验中可以找的抗原种类可以多到几十种，极大地提升了找抗原的效率。
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文章内容
文章的题目是《High-Throughput Mapping of B Cell Receptor Sequences to Antigen Specificity》
翻成中文，就是《B细胞受体序列到抗原特异性的高通量映射》
文章发表在2019年12月的Cell杂志上
作者是范德比尔特大学的博士研究生，Ian Setliff。
文章中用到的技术叫LIBRA-seq。
LIBRA-seq是 Linking B cell Receptor to Antigen specificity through sequencing 的首字母缩写
翻成中文，它的意思是：通过测序将B细胞受体与抗原特异性连接
LIBRA-seq的特点
1、快，实验周期是一周。实验可以从有免疫力的人外周血开始，不必要专门去免疫小鼠
2、多，一次可以针对多种抗原，来寻找相应抗体
3、全，得到的信息很全，一次实验就可以得到配套的抗原种类、抗体重链和轻链的全部序列信息
4、明，测序的数据，直接就提示了抗体对抗原的结合特异性、和对病毒的中和谱，信息很明确
LIBRA-seq的方法原理
第一步，是在抗原上通过生物素和链霉亲和素，连上PE荧光染料。PE荧光染料将用于下一步的流式细胞仪的荧光分选过程
再在抗原上连上带有特定条形码序列的DNA链，作为抗原识别标签。
在这个整个的实验有点象钓鱼，特点是一种鱼只吃某种特定的鱼饵，那多放几种鱼饵就可以一次多钓到一些鱼，给每种鱼饵都做上标签，那么抓到鱼之后就可以从鱼饵的标签来判定鱼饵的种类，进而能判定鱼的种类
第二步，把多种带标签的目标抗原，和有免疫力的人的外周血单核细胞进行混合孵育
孵育的目的，让抗原与带有对应抗体的B细胞进行相互识别，并且结合
第三步，把孵育过的混合液用流式细胞仪进行荧光分选
因为目标抗原是被标上了荧光染料的，所以结合有目标抗原的B细胞就会被分选出来
第四步，把分离出的带荧光抗原的细胞进行10x处理，10x仪器把细胞、抗原、带标签的凝胶微珠，分隔成一个一个的油包水的小液滴。
接着进行建库，通过逆转录，再用特定引物做PCR扩增，建成二代测序文库
通过二代测序，得到“配套的：抗原标签DNA序列-抗体重链序列-抗体轻链序列”，三个一组的紧密关联的核酸序列信息
第五步，有了抗体的基因序列，我们就可以通过基因重组表达，得到目标抗体
LIBRA-seq相比于传统开发单克隆抗体方法的优势
传统的方法，主要是两种，一种是用杂交细胞瘤，另一种是噬菌体展示
第一点，就是LIBRA-seq很快，从有免疫力的血液样本开始一直到得到基因序列，就花一周的工作时间
相比之下，用杂交瘤方法，至少要用5~8周。因为其中要把脾细胞与肿瘤细胞进行融合，再进行单克隆化，再进行免疫活性筛检。
LIBRA-seq的时间只相当于杂交瘤方法中细胞融合这第一个步骤所花的时间
所以说，LIBRA-seq是非常快的
第二点，可以用被感染过的、有免疫力的人的外周血，取其中的单核细胞，就可以做LIBRA-seq，也就是离心得到白细胞，就可以做LIBRA-seq，不一定要免疫小鼠或兔子。
这在要控制急性的传染性疾病，要制备中和抗体的情况，就直接省了免疫动物的时间。
第三点，LIBRA-seq能得到配套的目标抗原的条形码序列，和相应抗体的重链序列加轻链序列。
因为目标抗原、完整的B细胞，和带有条形码的微珠，被包在一个油包水的小滴中，保证了这三个组成成份的条形码序列，可以一次性地被完整地获得
相比之下，噬菌体展示，一个噬菌体只能保留轻链，或者重链序列，不能一次性获得一个抗体的配对的轻链、重链序列，还要后期再想办法配对，操作麻烦
第四点，一次实验可以筛多个抗原。
因为LIBRA-seq的实验过程中，用DNA标签对抗原做了标记，所以可以轻松区分多种抗原，这就允许一次实验中放入多种抗原作为钓抗体的鱼饵，并且一次筛到不同抗原的抗体
论文当中的例子，是一次筛9个抗原。作者Ian在一次网络演讨会中说团队实际上做过一次筛14个抗原的
第5点，“LIBRA-seq得分”直接显示了抗体的结合特异性
“LIBRA-seq得分” 就是指一个LIBRA-seq中测序测到的一种抗体基因在一种抗原上所表达的RNA的UMI数。UMI数多，说明这个抗体对这个“饵”蛋白咬得牢
实验证明，LIBRA-seq得分与ELISA识别准确度高度正相关
这里是9个抗体的编号，作者把这9个抗体表达成了重组抗体，与抗原做ELISA实验
这是LIBRA-seq得分，颜色越偏紫，则LIBRA-seq得分越高，
这是ELISA识别准确度，颜色越偏紫，则ELISA识别准确度越高。
我们可以清楚地看到，LIBRA-seq得分与ELISA识别准确度高度正相关
所以，LIBRA-seq得分可以指导挑选好的抗体，简化挑抗体的过程。
而且，“LIBRA-seq得分”是很容易统计的数据，就是数一下归属于特定抗原特定抗体的的UMI数。这很容易做到，
所以说，“LIBRA-seq得分”是一个方便统计的指标，而且指示效果也很明确
LIBRA-seq的运用实例
论文中一共对两个人的样本做了实验，这两个人都是HIV病毒的长期携带者
我们先说第一个供体，这个供体的编号是NIAID45。
之所以选择这个供体，因为他有一系列特点
第一个特点，是他17年前就被检出有HIV病毒，至今没有经过抗逆转录病毒的治疗，也就是没有经过针对艾滋病的治疗，但他现在活得很好
第二个特点，是之前有许多论文拿他的样本做了分析，所以对他这个样本已经有了很好的科研基础数据
实验中，是取了这个人的外周血中的单核细胞，也就是白细胞，做实验
用三种蛋白做饵蛋白，其中两个是HIV的包膜蛋白，另一个是流感的抗原蛋白
把这三种蛋白作为钓B细胞的钓饵，与白细胞进行混合，做实验
实验回收到了2321个有用的B细胞信息
这张图是抗体的谱系图
图中红色的抗体，是新发现的、抗HIV蛋白的抗体
黑色的抗体，是以前的论文中已经发现过的抗HIV的抗体
在整个抗HIV抗体谱系的各个分枝中，都有新发现的抗体
这说明：LIBRA-seq有充分的能力，来发现针对靶标蛋白的抗体
作者挑了几个的新抗体，用基因工程方法表达后，做抗体对病毒的中和能力的测试
从上到下，列的是一系列不同的HIV的伪病毒毒株
用三个重组抗体，来测试对这些伪病毒的中和能力。
这个VRC01是一个以前已经验证过的抗体，放在这里做阳性对照
图中红色表示中和能力强，上面标的IC50数字，是半抑制浓度，这个浓度的数值越低，说明抗体的中和能力越强
三个重组抗体中，两个表现出对各种HIV伪病毒的很强的中和能力，一个表现出很弱的中和能力
这个实验说明，LIBRA-seq找出来的抗体，大部分能够中和病毒
这对药厂开发针对病毒中和抗体很有意义
这张图，前面提到过，它说明LIBRA-seq找出来的抗体基因序列，经过基因工程表达成抗体后，能够很好地识别目标蛋白，“LIBRA-seq得分”与ELISA识别准确度有高度的一致性
接下来说第二个供体，他的编号是 NIAID N90
他的特点是，1，他携带HIV病毒活了23年，现在活得挺好
2，在先前的文章里从他身上鉴定了一种广泛的HIV中和抗体谱系，称为VRC38，但是供体N90的血清的病毒中和宽度，显著大于VRC38的中和宽度
所以想用LIBRA-seq方法从他的血液中找出更多的抗体
用9个饵蛋白做实验
其中5个是HIV的蛋白。这5个HIV蛋白，是来自5个不同的HIV毒株
4个是流感的蛋白
这是N90的抗HIV的抗体谱系图
图中红色的，是新找到的抗体。这说明LIBRA-seq是可以找到更多抗体的
之所以测N90这个供体，是想找中和谱更广的抗体，我们就来看找到的抗体的中和谱宽度
能够中和更多HIV毒株的抗体就是中和谱更宽的抗体
这里列出了5种抗原蛋白，也就是之前做饵蛋白的5种蛋白
LIBRA-seq得分直接可以看出哪些抗体与哪个抗原有结合，下图中的深黑色的圆点，就是有结合的
可以看到，最右边，有33种抗体能抗这里列的全部5种抗原蛋白
所以，可以根据LIBRA-seq得分来预判抗体的中和谱宽度
总结
