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人类肿瘤是由在复杂的肿瘤微环境中进化的不同基因克隆和恶性细胞状态组成的复杂生态系统。单细胞RNA测序（scRNA-seq）在过去十年中使我们理解肿瘤生物学的能力发生了翻天覆地的变化。今天，小编要和大家分享一篇2024年9月发表在Cancer Cell（IF：48.8）上的文章，作者回顾了人类肿瘤中scRNA-seq的头十年，并强调了从这些研究中收集到的一些强有力的见解。

文章简介

文章标题：Cancer cell states: Lessons from ten years of single-cell RNA-sequencing of human tumors

发表期刊：Cancer Cell

影响因子：48.8

发表时间：2024.9.9

研究方法：scRNA-seq

文章链接：

https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(24)00304-0?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS1535610824003040%3Fshowall%3Dtrue

文章概要

作者回顾了人类肿瘤 scRNA-seq 研究的第一个十年，并重点介绍了从这些研究中获得的一些重要启示。

首先，将重点放在稳健定义癌细胞状态及其多样性的计算方法上，并强调在不同癌症类型中观察到的一些最常见的基因表达肿瘤内异质性（eITH）模式；

然后，讨论该领域在定义和命名此类 eITH 方案时存在的模糊之处；

最后，强调了将促进未来研究和在临床环境中更广泛实施这些技术的关键发展。

技术解析

一、区分肿瘤间和肿瘤内表达的异质性

肿瘤间异质性反映了不同患者肿瘤的基因表达差异，通常是恶性细胞表达的主要组成部分。肿瘤内异质性需要单细胞数据来研究，近年来显著扩展。整合方法可以减少技术批次效应，但可能会扭曲数据。另一种方法是分别分析每个肿瘤，以直接定义肿瘤内异质性，然后比较不同肿瘤的模式。这部分强调了在基因表达水平上研究肿瘤内异质性的复杂性和重要性。

二、从scRNA-seq中定义eITH：聚类、伪时间和程序分数

在单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据中，确定一个肿瘤样本中癌细胞的不同亚群数量的复杂性。尽管许多研究使用聚类方法报告了特定的聚类数量，但结果往往依赖于所用方法和阈值。恶性细胞通常表现为转录程序的连续体，而不是离散的聚类，反映了细胞状态的多样性。癌细胞的动态行为（如癌细胞可塑性）进一步增加了复杂性。替代聚类的方法是将癌细胞按观察到的连续体排序（伪时间），但在癌症背景下，这种方法面临多方向进展和多轴同时变化的挑战。

替代伪时间的方法，即对癌细胞的多个表达程序进行“评分”。首先定义在多种肿瘤中反复出现的相关表达程序，然后用一组程序评分描述每个细胞，进行进一步分析。这种方法消除了方向性的假设，更适合癌症中的多维动态。提出了几个问题：哪些程序在特定肿瘤内变化？哪些程序在多种肿瘤中一致变化？这些问题与癌细胞在特定肿瘤中的变异过程和表型有关。后续部分基于最近的scRNA-seq肿瘤研究和元分析，讨论了eITH模式的相似性和各种eITH程序的相对频率。

图1. eITH分析方法

三、最常见的eITH分析：细胞周期和压力

由于scRNA-seq捕捉的是静态快照，只有少数癌细胞会在细胞周期中被分析。最常见的eITH模式是区分循环和非循环细胞。循环细胞的比例在不同肿瘤中差异很大，从低增殖肿瘤中的稀有（<1%）到快速增殖肿瘤中的多数。循环细胞可以进一步分为细胞周期的不同阶段，主要是G1/S和G2/M阶段。尽管一些研究排除了循环细胞，但它们在肿瘤中的分布和状态多样性是重要特征。试图规范scRNA-seq数据中的细胞周期阶段，但可能会简化和扭曲癌细胞增殖的复杂模式。

癌细胞的应激相关程序，这是肿瘤内异质性（ITH）的第二常见模式。包括缺氧相关程序（如血管生成、HIF抑制和葡萄糖摄取增加）、热休克反应和未折叠蛋白反应等。尽管生理应激多样，但这些应激相关程序通常共享一组基因，形成一个通用的应激程序，可能与药物耐受性有关。该程序由AP-1家族转录因子（如JUN/FOS）和ATF3等调控。应激程序在肿瘤解离过程中可能被人为放大，但在避免解离的研究中也频繁观察到，表明其在所有主要癌症类型中普遍存在。应激相关程序暗示了肿瘤细胞位置的重要性，不同肿瘤区域会使细胞受到不同的应激，如缺氧、营养限制、热、酸性等。最近的研究表明，癌细胞状态往往在空间上分离，反映了空间组学领域的快速发展。

四、eITH部分反映发育和生理过程

EMT在癌症中被认为增加了癌细胞的转移潜力、耐药性和免疫抑制能力。尽管EMT的存在和重要性存在争议，但许多单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究发现了富含间质相关基因的eITH程序，支持了EMT在癌症中的广泛重要性。这些程序在所有类型的上皮癌和一些非上皮癌中都被观察到。大多数EMT相关程序表现为部分或混合EMT，细胞同时表达上皮和部分间质标志物。尽管这些程序与转移、耐药性或生存率降低有关，但大多数scRNA-seq研究在直接从临床样本中检验这些关联方面统计能力不足。实验模型结合scRNA-seq可以更详细地研究耐药性的形成。

癌细胞如何利用发育和生理过程的部分版本，通常缺乏经典标志物，且表型难以评估。例如，细胞衰老程序在多种上皮癌中存在，但这些细胞不激活经典的衰老标志物（如p16和p21），仍保持一定的增殖能力。其他例子包括胶质瘤中的神经发育相关程序、黑色素瘤中的黑色素细胞样程序和慢性淋巴细胞白血病中的B细胞程序等。这些程序在不同癌症类型中表现为扭曲版本，增加了检测和解释的难度。研究表明，癌细胞常诱导正常发育或生理过程的扭曲版本，形成患者特异性表达谱，进一步诱导这些过程可能限制肿瘤增殖，提供临床益处。

图2. 癌症eITH通常反映发育或生理程序的有限版本

五、与免疫细胞相互作用相关的eITH

肿瘤单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究中免疫细胞，特别是T细胞的多样性及其对免疫治疗的影响。例如，一些研究报告了与免疫细胞排除相关的癌细胞程序，如滑膜肉瘤和结直肠癌中的免疫相关程序。上皮-间质转化（EMT）程序也与免疫抑制有关，但在胶质瘤中则与免疫活性增加相关。MHC-I基因在某些癌症中表达受阻，反映了免疫逃逸机制，而MHC-II基因常与干扰素反应基因一起被癌细胞诱导。这些基因的表达不仅限于癌细胞，还包括肿瘤微环境中的其他细胞类型，如成纤维细胞和内皮细胞。研究表明，在解释这些基因的表达谱时需要谨慎，特别是在大样本分析和免疫细胞类型频率评估时。

六、利用单细胞特征对Bulk RNA进行反卷积

单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据改进整体RNA测序（bulk RNA-seq）解卷积分析的方法。解卷积用于估计样本中细胞类型和状态的频率，使其组合表达谱与观察到的整体RNA-seq谱最佳匹配。尽管这种方法广泛应用，但存在局限性。标记基因通常不完全特异于某一细胞类型，导致解卷积精度受限，尤其是稀有细胞类型的频率估计容易出错。细胞周期、应激反应、间质程序（如EMT）、干扰素反应和抗原呈递等表达程序也会被多种细胞类型激活。因此，尽管解卷积是提取整体谱信息的有用方法，但结果需谨慎解释，特别是对于稀有细胞类型和标记基因特异性有限的情况。尽管解卷积技术进步，单细胞测量仍然是准确分析细胞状态的必要手段。

七、未来的发展：扩大单细胞图谱分析的范围

snRNA-seq技术使得冷冻样本的分析成为可能，避免了新鲜肿瘤组织快速解离的挑战。尽管snRNA-seq基因计数较低，但其生物过程与scRNA-seq一致，适合大规模临床样本分析。另一重要进展是使用福尔马林固定（FFPE）样本进行scRNA-seq和空间分析。尽管FFPE样本RNA降解严重，但新方法（如snPATHO-seq、snFFPE-seq和snRandome-seq）通过优化RNA提取和使用随机引物提高了FFPE分析的效果。这些方法对于在癌症医学中广泛实施sc/snRNA-seq工作流程至关重要。

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