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单细胞测序样本制备指南——细胞分选
发布日期：2023-02-13浏览：
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单细胞转录组测序技术能够对组织内部单个细胞进行基因层面的信息识别和挖掘，真实高效地还原血液或组织中全部的细胞组成和即时状态，在基础生物学研究、疾病治疗、肿瘤免疫及再生医学等方面都得到了广泛应用。由于单细胞测序对于上机细胞状态和浓度的高要求，结合细胞分选技术的单细胞测序能够优化细胞悬液质量，富集目标细胞群体，提高测序效率，为解离后活细胞比率低、目标细胞群体占比少的样本获取更多单细胞数据提供可能。
本文依据新开源dafabet手机黄金版结合20000例单细胞测序样本的经验，就各位老师关心的细胞分选过程中以及后续单细胞实验可能会面临的问题，提供参考建议和注意事项。
首先，在细胞分选方法的选择上，常见的有流式分选和免疫磁珠分选两种，二者各有优势不能互相取代。但对于后续单细胞测序实验来说，出于对细胞状态的考虑，如果磁珠分选能达到研究要求，一般首选磁珠分选。
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流式分选(FACS)
流式细胞术（FACS，Fluorescence-activated cell sorting）是一种利用荧光素标记不同的分子，通过调节合适的电压、补偿等，将目的细胞与非目的细胞区分开来的细胞分离方法。在单细胞测序领域，流式分选可以区分特定细胞群体，并能够对单细胞悬液进行质量优化，让研究目的性更强、准确性更高。
流式分选得到CD45 +细胞进行单细胞测序(J and JC et al., 2022)
实验建议
1.预实验：分选前建议先了解目标细胞的含量占比，以此优化流式细胞仪的分选条件；
2.分选时间：根据所分选细胞的耐受情况而定，保证细胞活率，建议在一小时之内完成；
3.细胞收集液：1×DPBS (或培养基) + 0.04％BSA / 5%FBS；
4.对于流式分选的细胞，需遵循非必要不冻存的原则。
优劣势
1.流式分选时间较长，对细胞刺激大；
2.流式分选可进行多参数、不同荧光强度的分选，且可进行多路分选，方式灵活，纯度高（>90%）；
3.流式分选对设备要求较高，需要分选型流式细胞仪。
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免疫磁珠分选（MACS）
免疫磁珠细胞分选，是在磁珠上连接能够与细胞表面抗原结合的特异性抗体，通过外加磁场，抗体与磁珠相连的细胞被吸附从而滞留在磁场中，以达到细胞分离的目的。根据所标记细胞的不同，磁珠分选通常可分为阳性分选和阴性分选两类。
免疫磁珠分选CD3+T细胞进行单细胞测序 (P and C et al., 2021)
实验建议
1.对于磁珠分选，阳选、阴选试剂盒的区分和选择尤为重要，需要关注分选试剂的可靠性、分选效率等；
2.预实验估测目标细胞比例，便于正式样本准备；
3.稀有细胞分选可选用采用复合分选法，此种方法主要用于细胞亚群的分选或高纯度细胞分离；
4.分选后的细胞容易结团，避免高速离心富集。
优劣势
1.磁珠分选速度快、刺激小，获得的细胞活率高；
2.磁珠分选的分选精度有限，少量非目标细胞可以在数据分析阶段进行剔除；
3.磁珠分选对设备要求较低，需要磁珠分离装置。
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细胞分选注意事项
1.裂红处理：原样品中若有肉眼可见红色沉淀，应先裂解红细胞，但需注意裂解时间，避免对其它细胞造成损伤；
2.计数矫正：流式分选的细胞计数值可能会比真实细胞总量偏高（20-80%），需要计数仪或镜检进行计数矫正；
3.收集细胞：建议离心机转速在500g以内，超过500g容易导致细胞重悬不开或结块；如果担心收集不到细胞，可增加离心时间。
收集不到细胞原因可能有：
① 离心机故障或陈旧，离心力低于设置值。
② 细胞重悬液体积过大，或血清含量过高。
③ 存在细胞直径过小的细胞类型。
4.最终的单细胞悬液需符合上机要求（上机要求详见下表所示）。
高质量细胞悬液上机标准
细胞总数：细胞总数＞1×105 cells
细胞数少不足以准确质控，质控不准容易引发测序数据质量问题。
细胞浓度：700-1200 cells/µl
保证一定体积能有足够稳定的高质量细胞用于上机，重复计数浓度波动不超过 ±100 cells/µl 。
细胞直径：5 µm ≤ 目标细胞直径 ＜40 µm
推荐使用40 µm及以下孔径的细胞过滤器过滤掉细胞碎片及结团细胞，细胞直径过小多细胞率增加，细胞直径过大易出现堵孔或捕获效率偏低的情况。
细胞活率：细胞活率≥85%
细胞活率作为体现RNA完整性的重要参考指标，对于有重度损伤或解离过度的细胞并不能很好的体现RNA完整性，所以细胞活率原则上越高越好。
悬液情况：使用不含Ca2+、Mg2+、EDTA的PBS或培养基充分重悬
用DPBS+0.04%BSA清洗两遍，细胞悬液中应尽量减少细胞结团、细胞碎片过多，大碎片存在或其它杂质存在的情况。细胞上机重悬液中无金属Ca2+、Mg2+、EDTA等影响反转录酶活性的物质存在。
细胞直径：5 µm ≤ 目标细胞直径 ＜40 µm
推荐使用40 µm及以下孔径的细胞过滤器过滤掉细胞碎片及结团细胞，细胞直径过小多细胞率增加，细胞直径过大易出现堵孔或捕获效率偏低的情况。
参考文献：
【1】Biermann Jana,Melms Johannes C,Amin Amit Dipak et al. Dissecting the treatment-naive ecosystem of human melanoma brain metastasis.[J] .Cell, 2022, 185: 2591-2608.e30.
【2】Gueguen Paul,Metoikidou Christina,Dupic Thomas et al. Contribution of resident and circulating precursors to tumor-infiltrating CD8 T cell populations in lung cancer.[J] .Sci Immunol, 2021, 6: undefined.
