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10x案例解析 | 单细胞测序助力果蝇衰老过程中细胞图谱的绘制
发布日期：2019-08-30浏览：
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10x Genomics单细胞转录组测序如火如荼，在探索复杂的大脑神经细胞中屡立战功。
果蝇的大脑含有数百种不同类型的神经元和构成复杂网络非神经元细胞。2018年，Cell发布了一篇由比利时鲁汶大学的研究人员撰写的文章“A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Aging Drosophila Brain.”该研究绘制了果蝇衰老过程中的细胞图谱。
研究思路：
主要研究结果：
● 成人果蝇大脑在衰老过程中的单细胞图谱
● 网络推断揭示了大脑调节状态与氧化磷酸化相关
● 尽管基因表达呈指数下降，但在衰老期间仍保留细胞身份
● 网上共享数据库SCope的构建，用于探索和比较不同物种的单细胞数据集
结果详解
01 果蝇大脑的细胞图谱（10x Genomics单细胞RNA-seq）
经过数据质控分析得到高质量的细胞，对57k 个细胞进行无监督聚类，初步得到87个 clusters。依据cluster特异表达的基因与之前发表的已知细胞类型的marker基因对细胞进行鉴定，初步分为三大类神经元：24,802个(43.6%)胆碱能神经元 (VAChT)、13,296个(23.4%)谷氨酸能神经元 (VGlut)、6,177个(10.8%)GABA能神经元(Gad1)。按神经元和非神经元分为两大类群。
接下来对细胞进行亚型细分和类型鉴定，如下：
神经元进一步细分亚型，通过marker基因识别细胞类型可鉴定：
● serotonergic neurons(SERT)
● octopaminergic/tyraminergic neurons(Tdc2)
● dopaminergic neurons(PLE)
非神经元细胞细分亚型，通过marker基因识别细胞类型可鉴定：
● 星形胶质细胞(alrm)
● 皮质胶质细胞(wrapper)
● 血细胞(hml)
● 神经周膜(vmat)
● 神经外膜下胶质细胞(moody)
通过基因ey和prt识别KC细胞（蘑菇体(MB)是果蝇的学习和记忆中心，由Kenyon cells (KCs) 组成），通过组合多个marker基因对MB脑叶细胞细分亚型：α/β叶(sNPF)、α'/β'叶(trio)（并找到其新的marker基因DAT）、γ 叶(sNPF，trio)。利用组合多个marker基因的识别方法，作者还对视叶细胞进行了亚型细分，进一步鉴定多种神经元细胞。
综上，利用上述方法，作者一共鉴定出87种大脑细胞类型，绝大部分是神经元细胞，还有少部分的非神经元细胞，如神经胶质细胞和血细胞。
作者还进一步评估了性别、年龄、基因型和生物学重复对细胞聚类和类型的影响，发现除了cluster23之外，所有cluster都有很高的重现性，基本没有出现差异。
02 鉴定未被识别的稀有细胞类型
利用dFBR23E10-Gal4流式分选dorsal fan-shaped bodyneurons（dFB）细胞，并进行低通量的单细胞测序：R23E10-GFP分选dFB细胞→CEL-seq(22 cells)、smart-seq2(45 cells、34 cells)，并结合10x Genomics测得的57k个高质量单细胞转录组数据进行映射，发现在87个cluster中，cluster61与目的分选的dFB转录组数据最匹配。对cluster 61进一步聚类分析得到7个细胞亚群。
也可以利用已发表明确的细胞亚型的转录组数据，与10x Genomics测得的单细胞数据结合分析，对细胞群进行亚聚类，进而鉴定难以识别的稀有细胞类群。如OPNs细胞亚型、多巴胺能神经元亚型、肽能神经元亚型等。
03 利用SCENIC绘制细胞间的调控网络
利用SCENIC鉴定了150个TF，其motif显著富集于共表达的基因集。使用基因调控网络进行细胞聚类，得到不同于依据基因表达的聚类结果。发现这些细胞类型具有特殊的TF网络，如OPNs的TF网络、视叶细胞的TF网络等。
对于预测得到TF和motif，一是可以对TF进行GO富集分析，结合已发表的数据，与已发表的文献信息比较进而间接求证；二是通过实验直接验证，作者通过Bulk ATAC-seq对预测的Onecut结合位点是否位于基因组中的开放染色质中进行实验验证，分析确定Onecut位点强烈富集ATAC-seq信号，其在许多神经元类型中具有广泛的活性，即Onecut有特别强的泛神经网络。
04 大脑调节状态与氧化磷酸化预测
根据几个关键的调控因子组合对神经元进行分类，大致可以将大脑中的神经元细胞分为三类，central brain A（Dati和Pros）、central brain B（Imp）、optic lobe（Scro）。比较这三类神经元的差异基因表达谱并进行GO富集分析，发现与中央脑A相比，在视神经叶和中央脑B中涉及与ATP代谢和氧化磷酸化相关基因的显著上调（中央脑B的线粒体reads显著增加），并利用mitoTimer实验进行体内验证。因此，作者推断可以通过TFs的特定组合预测参与氧化磷酸化基因的表达水平。
05 衰老对细胞的影响
作者已评估了性别、年龄、基因型和生物学重复对细胞聚类和类型基本没有影响，但发现衰老对细胞存在以下影响：其一，UMI数量和基因数量在衰老过程中呈指数下降，这种现象出现在所有神经元和神经胶质细胞中；其二，神经元和神经胶质的成分比例略有变化，神经胶质细胞随年龄增长而相对增加；其三，细胞大小随着年龄的增长而减小，这与mRNA含量的下降相一致。作者通过分析基因表达与年龄的相关性，与核糖体相关的基因在衰老过程中表达上调，参与氧化磷酸化的基因表达下调，利用这些特征基因对细胞进行年龄预测。
总结：
作者利用10x Genomics单细胞平台，对数万个脑细胞进行聚类分析，寻找marker基因定义各类神经元和非神经元细胞类型，共发现了上百种大脑细胞，绘制了果蝇大脑老化过程中的神经系统图谱，并探索构建了不同类型细胞之间的联系。作者最后还创建了网上共享数据库Scope，可以供其他学者探索大规模单细胞数据集的基因表达和基因调控分析，这类细胞图谱研究为更好的理解大脑功能特征和疾病发展等做出了重大的科学贡献。
参考文献：
Davie K, Janssens J, Koldere D, et al. A Single-Cell TranscriptomeAtlas of the Aging Drosophila Brain. Cell. 2018;174(4):982-998.e20
