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10x 解读 | 单细胞转录组学探索人PSC衍生肾脏类器官分化
发布日期：2019-08-14浏览：
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华盛顿大学医学院肾脏病学部（2018年12月）
? 技术
单细胞转录组平台：10x Genomics Chromium™和Drop-seq
测序平台：HiSeq 2500、Navoseq 6000
器官/细胞类型：肾脏类器官、胎儿肾脏、成人肾脏
细胞数：4524个细胞核和83,130个细胞
? 主要结果
通过单细胞转录组学比较两种人肾脏类器官分化方案
两种方案均产生10％-20％的非肾细胞
与胎儿和成人肾脏相比，肾脏类器官细胞不够成熟
抑制BDNF-NTRK2信号传导可使非肾细胞减少90％
? 主要内容
1. scRNA-seq鉴定肾脏类器官的细胞多样性
所有类器官细胞的无监督聚类得到23个相对独立的细胞群，每个细胞群特异表达marker基因。并且发现大量的非肾细胞类型（神经元细胞、肌细胞、疑似黑素细胞群）。
在两种诱导分化方法下，统计不同细胞类型的组成比例：
>>>基于Morizane方案生成更多的足细胞，更适合肾小球生物学分析
>>>基于Takasato方案生成更多的管状上皮细胞，更适合管间质研究
>>>Morizane或Takasato方案都无法产生输尿管芽细胞
2. 绘制发育相对成熟的Day 26肾脏类器官的细胞图谱
对Day 26的肾脏类器官进行细胞聚类和类型鉴定，并对其中的Tubular细胞群进一步聚类分析和类型鉴定，两种分化方案各检测到8种（Morizane）、 5种（Takasato）管状细胞亚型。
3. 肾脏类器官细胞成熟情况的鉴定
将类器官细胞类型基因特征与已发表小鼠、人单细胞转录组数据进行比较，在类器官细胞中没有明确的输尿管芽或集合管细胞。并将肾脏类器官与本文研究所测的胎儿肾脏（scRNA-seq）和成人肾脏（snRNA-seq）进行比较。观察到类器官相应的细胞类型和成人肾脏之间的预期相关性和差异性，结果表明类器官发育还不够成熟。
4. GWAS预测的疾病相关基因在成人和肾脏类器官中的表达情况
为了评估肾脏类器官可能用于模拟疾病相关基因的有用性，比较了成人肾脏与类器官中GWAS基因表达的能力。与成人肾相比，肾脏类器官在预测性状相关细胞类型方面的能力有限，许多GWAS 基因在类器官细胞类型中不表达。
5. 重建肾脏发育轨迹
对五个不同时间点的肾脏类器官scRNA-seq聚类分析，鉴定不同发育时间点下肾脏类器官基因表达特征和细胞类型。第0天：多能性基因表达(例如，POU5F1或OCT4)。第7天：多功能基因完全下调，后肾间充质标记物上调(SALL1, FGF18, HOXB9)。第12天：与肾小管前聚集体最为相似，此时JAG1和LHX1等基因高度富集。第19天和第26天：出现多个与分化细胞类型相对应的细胞群，这两个时间点出现大多数较晚的细胞群，反映了异步分化的特征。随着时间点的延长，分化相关的基因表达随时间增加，某些祖细胞标志物如CITED1随时间降低（图6C），但是发育相关的许多基因在第26天持续存在。
为了检测肾脏类器官分化期间的基因表达变化，通过使用Monocle2进行拟时轨迹分析来重建肾脏谱系关系，将标记基因的表达情况投射到拟时轨迹上来定义细胞的命运，得到的细胞轨迹揭示了两个主要的分支点。
6. 改善类器官分化方案
1）延长培养时间
将Takasato方案中的类器官生长至34天，并对6,115个细胞进行scRNA-seq，结果分化效果更差，大多数细胞群中分化标志物表达减少，表达了高比例的线粒体基因，表明这些细胞不健康，并且非肾脏细胞增多。
2）抑制BDNF-NTRK2信号减少非肾脏细胞
在类器官分化过程中转录因子特异性表达，通过鉴定大量动态表达的转录因子，大多数仅在一种或几种细胞类型中表达。其中五个基因（POU2F2、POU3F2、NHLH2、HES6和LHX9）表达局限于神经元细胞群。通过抑制BDNF-NTRK2信号，减少神经元细胞的比例。
? 结论
1. 这些结果将有助于指导对肾脏功能或疾病建模感兴趣的研究人员选择方案。
2. 分析信号通路和转录因子表达前后的分支点将提供其他潜在的研究策略以调节类器官的发育分化命运。
参考文献
Wu H, Uchimura K, Donnelly EL, et al. Comparative Analysis and Refinement of Human PSC-Derived Kidney Organoid Differentiation with Single-Cell Transcriptomics. Cell Stem Cell. 2018 Dec 6;23(6):869-881.e8. doi:10.1016/j.stem.2018.10.010.
