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来自英国威康基金会桑格研究所和欧洲分子生物学实验室（EMBL）欧洲生物信息学研究所等研究机构的研究人员对6种哺乳动物物种中的25万多个细胞的基因进行测序，利用利用10x scRNA-seq和ChIP-seq 分析证实了免疫反应中的基因是如何在不同细胞和物种间具有不同的活性。相关研究结果以“Gene expression variability across cells and species shapes innate immunity”为题，于2018年10月24日发表于Nature期刊。

不同细胞和物种间的基因表达差异塑造先天性免疫

研究思路

      1.使用来自灵长类动物（人和猕猴）和啮齿动物（小鼠和大鼠）的原代真皮成纤维细胞对多聚肌苷的反应：聚胞苷酸（poly（I：C）或dsRNA）（图1,左）。使用Bulk RNA-seq来研究物种之间的转录差异，并使用Single-cell RNA-seq来估计基因表达中的细胞间差异；使用启动子序列分析以及染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）来研究物种间和跨细胞的每个基因表达变化如何与其启动子的结构相关；此外，还研究了基因编码序列中的跨物种差异与宿主- 病原体相互作用所施加的表达和限制之间的关系。

2.使用来自小鼠、大鼠、兔和猪的第二系统-骨髓衍生的单核吞噬细胞对脂质多糖（LPS）的反应（图1,右）。同样，使用Bulk RNA-seq与Single-cell RNA-seq来进行研究。

图1.研究思路

主要研究内容

1. 免疫反应的转录差异

首先，研究成纤维细胞对4种物种（人、猕猴、大鼠和小鼠）中dsRNA（poly（I：C））刺激的转录反应。使用跨物种Bulk RNA-seq数据表征每个基因的物种之间对dsRNA的响应差异。虽然一些基因，如编码NF-κB亚基RELB和NFKB2的基因，在物种间的反应相似，但其他基因在灵长类动物和啮齿动物进化中的反应不同（图2,左）。如Ifi27（编码针对多种病毒的限制因子）在灵长类动物中显著上调，但在啮齿动物中没有，而Daxx（编码抗病毒转录抑制因子）表现相反。

同样，对于来自小鼠、大鼠、兔和猪的脂多糖（LPS）刺激的单核吞噬细胞组成（图2,右），一些基因对物种的反应相似（如Nfkb2），而其他仅在特定分支中显著上调（如Phlda1）。

图2. 基因表达倍数变化

左：成纤维细胞中dsRNA刺激；右：吞噬细胞中LPS刺激

2.差异基因的启动子结构

测试转录反应的差异是否反映在启动子功能和序列的保守性中。使用ChIP-seq，在所有物种的成纤维细胞中分析活性组蛋白标记。使用H3K4me3 ChIP-seq峰来定义人成纤维细胞中响应基因的活性启动子区域。转录因子结合基序（TFBM）的密度在高差异基因的活性启动子区域中显著高于在低差异基因中的密度（图3a）。当比较高分辨率和低差异dsRNA响应基因中核心启动子区域的保守性时，发现响应dsRNA高差异的基因在该区域显示出更高的序列保守性（图3b）。另外，发现TATA盒与较高的转录差异相关，而具有CGI的基因在成纤维细胞和吞噬细胞中分化得更慢（图3c）。因此，富含TATA盒和耗尽CGI的启动子结构与更高的转录差异相关，同时在这些基因的上游需要更高的序列保守。

图3. 转录差异基因独特的功能和启动子结构

3. 免疫应答中的细胞间变异性

为了研究单个细胞中基因表达的异质性，在免疫刺激后的一个时间对所有物种进行Single-cell RNA-seq。发现物种间反应高度不同的基因在物种内单个细胞的表达变化也更大（图4a）。细胞间变异性之间的关系在成纤维细胞中的955个dsRNA响应基因和吞噬细胞中的2336个LPS响应基因中是正确的。接下来，检查启动子元件（CGI和TATA盒）的存在与基因的细胞间变异性之间的关系，发现在启动子中具有TATA盒的基因具有较高的转录变异性，而含有CGI的基因倾向于具有较低的变异性（图4b）。因此，细胞之间的转录变异性和物种之间的转录差异与特定启动子元件的存在相关。

图4. 免疫应答中的细胞间变异性和响应差异变化

4. 先天免疫的进化景观

使用成纤维细胞中的955个dsRNA响应基因，评估低、中和高差异基因的编码序列进化。在转录反应中快速进化的基因具有比低差异的dsRNA响应基因更高的编码序列差异（图5a）。测试基因在反应中的差异与基因家族在脊椎动物进化过程中扩张和收缩速度之间的关系，发现转录不同的dsRNA响应基因具有较高的基因增加和丢失率（图5b），因此也在进化上更年轻（图5c）；还发现快速分化的基因往往具有较少的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）（图5d）。这些结果表明，转录不同的dsRNA响应基因通过各种机制快速进化，包括快速编码序列进化和更高的基因丢失和重复事件率。

通过编译人类已知宿主-病毒相互作用的数据集来研究转录差异与病毒蛋白相互作用之间的关系，其产物没有已知病毒相互作用的基因比编码具有病毒相互作用的蛋白质的基因显示出更高的差异，此外，病毒免疫调节剂破坏宿主免疫系统的病毒蛋白靶向的基因的转录差异仍然较低（图5e）。

结果表明，病毒通过与其反应中相对保守的免疫蛋白相互作用而进化为调节免疫系统。图5f中的结果突出了细胞因子和其他代表性dsRNA响应基因之间的调节和进化特征的差异。细胞因子通过各种进化机制快速进化，并且在细胞间具有更高的转录变异性。相比之下，参与免疫应答调节的基因，如转录因子和激酶，在细胞中更保守，异质性更低。这些基因编码的蛋白质与其他细胞蛋白质的相互作用更多，这表明它们的进化受到更高的限制。这组保守基因更常被病毒靶向，揭示了宿主-病原体动力学与先天免疫反应的进化景观之间的关系。

图5.响应差异与其他进化模式的关系

结论

作为抵抗病原体的第一道防线，细胞产生先天免疫反应，其在细胞与细胞之间变化很大。本文描述了先天免疫反应的物种之间的转录差异和细胞之间表达的变异性。使用免疫刺激的成纤维细胞和来自不同物种的单核吞噬细胞的Bulk RNA-seq和Single-cell RNA-seq，绘制了先天免疫反应的结构；转录差异基因，包括编码细胞因子和趋化因子的基因，在细胞中不同的启动子结构；相反，参与调节这种反应的基因，例如编码转录因子和激酶的基因，在物种之间是保守的，并且在表达中表现出低的细胞间差异性。

论文通信作者、威康基金会桑格研究所细胞遗传学主任Sarah Teichmann博士说，“在单细胞分辨率下DNA测序的强大功能意味着开展这种类型的研究如今是可行的。据估计，人体有37万亿个细胞，每个细胞具有相同的遗传密码。但是不同的细胞具有不同的表现，它们以不同的方式使用遗传密码。通过研究单个细胞，我们能够理解生命的这些基础的构成单元（building block，这里指的是细胞）以及它们如何一起合作，包括它们如何抵抗病原体。”

参考文献

Tzachi Hagai, Xi Chen, Ricardo J. Miragaia,et al.Gene expression variability across cells and species shapes innate immunity. Nature, 24 October 2018.