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Science丨口腔细菌异位定植于肠道可引发TH1细胞感应及炎症反应
发布日期：2018-02-23浏览：
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口腔来源的细菌定植于肠道会造成一些不良健康结果，诸如炎症性肠病等。然而，口腔微生物是如何异位定植于肠道的，人们对其中的因果关系仍知之甚少。
利用无菌动物技术，日本研究人员发现从唾液中分离出来的Klebsiella spp.定植于肠道后，可显著诱发Th1细胞。Klebsiella spp.菌株耐多种抗生素，当肠道菌群发生紊乱时定植，并在宿主具有遗传易感性的条件下造成严重的肠道炎症反应。该研究认为口腔可能是一个潜在的肠道致病有机体来源，加重肠道疾病反应。
研究思路
1. 取两名克罗恩症（CD）患者的唾液（CD#1, CD#2），进行无菌小鼠（GF）灌喂，小鼠种系为C57BL/6, BALB/c,及IQI小鼠。灌喂后隔离培养6周。
2. CD患者唾液及灌喂小鼠粪便进行16s rRNA测序（Roche 454平台，V1-V2区）。
3. 唾液灌喂培养的小鼠小肠及结肠粘膜固有层（LP）进行免疫细胞检测。
4. 利用GF+CD#2分离培养诱导Th1细胞的细菌，获得224个克隆，基于16s测序进行菌种鉴定。分离培养后再进行GF小鼠灌喂研究。
5. 接种确定的Th1诱导菌株后，对小肠细胞的转录组变化开展研究，确定与该反应相关的基因及发挥的作用。
6. 重复健康人及溃疡性结肠炎（UC）病人唾液微生物及灌喂无菌小鼠实验，验证口腔微生物定植于肠道炎症性反应之间的关系，探讨相关作用机制。
主要结果
口腔中的一部分微生物会在特定环境下定植于肠道，导致肠道免疫系统异常激活，进而造成慢性炎症性反应。
通过16s rRNA测序，研究者发现相对于酒精中毒或健康人群样本，患有溃疡性结肠炎（UC）、玛丽硬化性胆管炎（PSC）、胃食管反流症（GERD）的患者，其粪便中常见口腔耐氧菌的丰度显著性增高（Fig.1A）；因此，研究者提出假设，并且设计了本次实验。
K. pneumonia 2H7 (Kp-2H7)菌株定植于肠道，能诱导Th1细胞，具备多种抗生素耐药性，能造成严重的炎症反应
两名CD患者的唾液微生物构成一致性较高，但灌喂小鼠的粪便微生物存在显著差异（Fig.1C）。CD#2患者唾液灌喂的小鼠肠道中，TH1显著性增高，而CD#1灌喂小鼠的肠道T细胞并无显著变化（Fig.1B）。
定植于肠道的口腔微生物中，Kp-2H7菌株是诱导Th1细胞的主要菌种（Fig.1D）。Kp-2H7具有多种抗生素耐药性，会造成严重的炎症反应（Fig.1G-I）。同时Th1细胞的增加也与Kp-2H7在肠道内的定殖相关（Fig.1E-F）。
Fig.1 人类唾液微生物菌群中Klebsiella pneumoniae菌株的分离
K. pneumoniae菌株特异性诱导Th1细胞
用热灭活的Kp-2H7灌喂GF小鼠三周发现，热灭活菌株对诱导Th1无效(Fig.2A)。
对不同菌株开展全基因组分析发现，有61个同源基因与Th1细胞诱导能力成正相关（Fig.2D）。在缺乏ATF-like3 (Batf3-/-)的小鼠中，Kp-2H7无法诱导Th1 (Fig.2E)，并且缺失因子不同，Kp-2H7诱导Th1的效果也不同 (Fig.2F, G)。
对接种Kp-2H7和BAA2552一周的ECs和DCs做转录组测序发现，在Kp-2H7接入的野生型无菌小鼠中IFI诱导基因、组织相容性抗原复合体等的表达均上调，而在IFI受体缺陷型小鼠（IFNgR1-/-）中接种Kp-2H7则不会有相应的反应（Fig.2I）。
Fig. 2 K. pneumoniae菌株特异性诱导Th1细胞
在肠道中诱发Th1细胞的是Klebsiella的不同株系
为进一步证明口腔微生物与Th1诱导间的关系，研究追加了健康人的唾液微生物，UC病人及口腔唾液灌喂野生型B6小鼠。结果显示，2号UC患者唾液微生物灌喂会引发Th1诱导（Fig.3A）。
研究人员发现，在肠道Th1诱导中起主要作用的口腔微生物为Ka-11E12。与Kp-2H7作用相似，Ka-11E12还具有多种抗生素耐药性（Fig.3D），并在Il0-/-小鼠中引发各类炎症反应。同样该菌株也不会在ES表面产生损伤（Fig.3F）。
Fig. 3 Klebsiella aeromobilis是另一种Th1诱导口腔来源的细菌物种
炎性肠病患者的Klebsiella菌相对含量显著升高，并与Th1诱导相关基因具有关联性
对16s rRNA测序数据进行深度分析，发现在CD、PSC、酒精中毒的人群中Klebsiella菌的相对含量都显著高于健康人群（Fig.4A）。基于此，研究者拓宽研究范围，在IBD患者体内也发现Klebsiella菌的相对含量显著升高。同时，在含有Klebsiella菌的IBD患者的粪便研究中，研究人员也富集到了Kp-2H7介导的Th1诱导相关基因，但对于不含有Klebsiella菌的IBD患者，则没有相应的富集（Fig.4C, 4D）。
Fig. 4 IBD患者中Klebsiella菌与Th1相关基因间的关联
参考文献：
Atarashi K, Suda W, Luo C, et al. Ectopic colonization of oral bacteria in the intestine drives TH1 cell induction and inflammation[J]. Science, 2017, 358(6361): 359-365.
