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Cell Stem Cell | 10x单细胞转录组测序揭示肠内分泌谱系细胞具有肠道干细胞活性
发布日期：2017-10-17浏览：
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肠道具有明显的再生潜力，肠道干细胞（ISCs）位于增生性隐窝，可产生祖系细胞，这些祖细胞具有多谱系细胞分化，维持稳态及创伤性再生的能力。
通过对小鼠ISC群体进行单细胞转录组测序，Yan等人定义Bmi1-GFP+和 Prox1+细胞为肠内分泌谱系细胞，并在稳态和损伤诱导再生的过程中，具有肠道干细胞活性。研究发表于2017年7月的Cell Stem Cell（IF:23.393）
研究亮点：
>Bmi1-GFP+细胞含有丰富的肠内分泌标记，包括Prox1。
>在体外Prox1-GFP+细胞会一直保持无性生长，在体内谱系追踪结果显示Prox1+细胞在稳态维持和受到辐射损伤后会保持长期的克隆。
>细胞聚类分析将Prox1-GFP+细胞分成两个亚群，一个与成熟内分泌细胞（EE）类似，另一个的内分泌基因表达水平较低但是却与tuft细胞标记基因（Lgr5、Ascl2）共表达。
>谱系追踪显示，Prox1+细胞有助于隐窝动态平衡和再生
1. 单细胞转录组测序探讨肠道干细胞（ISC）之间的内在联系
层次聚类分析显示可将细胞分为2个亚类（cluster），Cluster 1 主要包括Lgr5hi 细胞，还有Cd166+, Cd24lo, Grp78-细胞。Cluster 2 由Bmi1-GFP+ 和 mTert-GFP+ 细胞组成。Hopx+, Dclk1+, lower SP细胞处于Cluster 1和 Cluster 2的中间位置。Cluster 1表现出 cycling crypt-based columnar cells (CBCs)的特征，包括Lgr5, Ascl2, Olfm4, Cd44, Sox9, Znrf3, Tnfrsf19。GSEA分析显示Cluster 1主要参与发育和离子运输过程。
图1 ISC群体的层次聚类
2. Cluster 2是由Bmi1-GFP+ 和 mTert-GFP+ 细胞组成，均具有肠内分泌细胞 (EE) 的特征。
mTert-GFP细胞中差异基因有Chga, Ghrl, Gip, Reg4，基因集太小不能进行GSEA分析，而在Bmi1-GFP+细胞中有840个差异基因。在Bmi1-GFP+ 细胞中EE分泌因子和EE转录因子基因高表达，而Cluster 1 CBC特征基因（Lgr5, Ascl2, Olfm4）则低表达。90% Bmi1-GFP+细胞与EE分泌因子基因 ChgA 共定位。 Bmi1+细胞中表达的EE基因就是EE标志物，同样在Dll1+和label-retaining cells（LRC）损伤诱导的ISC群体中可检测到。 Bmi1+和LRC 转录组结果显示确实有一些共有基因—Gip,Pax6, Rfx6, Peg3, Chga, Chgb。Bmi1-GFP+ 细胞显示出长时间的无性生长，具有干细胞/祖细胞潜能。
图2 Bmi1/mTert ISC集群的特征描述
3. 单细胞转录组测序显示Prox1 在大多数小的肠道内分泌细胞中表达，Prox1蛋白在74%的Bmi1-GFP+ 细胞中都能检测到。
从小鼠分离的Prox1-GFP+ 细胞可长成类似于肠的形状，与Bmi1-GFP+ 细胞相似。在Prox1-GFP; Prox1-CreER; Rosa26-tdTomato标记的小鼠中，它莫西芬处理36h后，一部分隐窝会出现1-2个Prox1+上皮细胞，分散在绒毛中。对它莫西芬处理的Prox1-CreER; Rosa26-tdTomato小鼠进行持续追踪，发现从9到395天一直能观察到 Prox1+ 细胞，说明隐窝基部的Prox1+ 细胞具有增殖潜能。另外，还发生了多谱系分化，包括enterocytes，goblet cells，EE cells，Paneth cells。Bmi1+ ISCs具有辐射和损伤诱导的增殖潜能，作者进行辐射实验发现Prox1+ ISCs 也具有再生能力，说明Prox1+ 和Bmi1+肠道上皮细胞有相似的功能。
图3 Bmi1-GFP+和Prox1+细胞在体内具有功能相似性
4. 作者从小鼠中分离 >1,000 Prox1-GFP+ 细胞，共获得1051个细胞，分成6个群体。
Clusters 0–3代表tuft 细胞，marker基因Dclk1 和Trpm5共表达。Cluster 4代表分泌的EE细胞， EE marker 高表达。
图4 Prox1-GFP+细胞的单细胞转录组
5. 探索 Prox1+细胞的特性及与Bmi1- 和Lgr5-细胞的重叠程度
作者比较1607个FACS分离的Lgr5-eGFP+细胞，658个隐窝Bmi1-GFP+ 细胞，246个Prox1-GFP+ 细胞和1010个 Lgr5-eGFP-肠上皮细胞，通过PCA分成13个cluster。Prox1-GFP+ 或 Bmi1-GFP+细胞与Lgr5-eGFP+细胞没有明显的重叠。>92% 的Bmi1-GFP+ 细胞表达EE分泌标志物-Chga, Chgb, Cck, Sct, Gip, Glp-1, Pyy, Nts，说明该细胞的主要身份是EE谱系细胞。Bmi1-GFP+ 细胞分成5个不同的EE亚群-Clusters 3, 6, 7, 10, 12，虽然有重叠但在5个亚群中EE分泌标志物的表达还是有差异的，比如Sct 和 Chgb在5个亚群中均高表达，而Chga, Gip, Tac1, Tph1, Sst, Nts, Reg4,Cck 在5个亚群的表达存在差异，反映了已知的EE细胞具有异质性。Prox1-GFP+ 细胞被分成2个主要的亚群，~52% 的 Prox1-GFP+细胞与Cluster 3重合，EE marker基因（Cck, Neurod1, Nts）在Prox1-GFP+细胞中高表达。剩余的Prox1-GFP+细胞属于Cluster 8，与tuft cells表达谱一致。
图5 在单细胞分辨率下Prox1-GFP+, Bmi1-GFP+, and Lgr5-eGFP+细胞间的直接比较
6. 对Bmi1-GFP+ 和Prox1-GFP+细胞进行 SPADE (Spanning Tree Progression of Density- normalized Events)分析来推测肠道发育轨迹。
图6 SPADE单细胞基因表达谱分析揭示Prox1-GFP和Bmi1-GFP细胞集群间的关联
参考文献：
Intestinal Enteroendocrine Lineage Cells Possess Homeostatic and Injury-Inducible Stem Cell Activity（Cell Stem Cell, 2017）
Intestinal Enteroendocrine Lineage Cells Possess Homeostatic and Injury-Inducible Stem Cell Activity（Cell Stem Cell, 2017）肠道具有明显的再生潜力，肠道干细胞（ISCs）位于增生性隐窝，可产生祖系细胞，这些祖细胞具有多谱系细胞分化，维持稳态及创伤性再生的能力。
通过对小鼠ISC群体进行单细胞转录组测序，Yan等人定义Bmi1-GFP+和 Prox1+细胞为肠内分泌谱系细胞，并在稳态和损伤诱导再生的过程中，具有肠道干细胞活性。研究发表于2017年7月的Cell Stem Cell（IF:23.393）
研究亮点：
>Bmi1-GFP+细胞含有丰富的肠内分泌标记，包括Prox1。
>在体外Prox1-GFP+细胞会一直保持无性生长，在体内谱系追踪结果显示Prox1+细胞在稳态维持和受到辐射损伤后会保持长期的克隆。
>细胞聚类分析将Prox1-GFP+细胞分成两个亚群，一个与成熟内分泌细胞（EE）类似，另一个的内分泌基因表达水平较低但是却与tuft细胞标记基因（Lgr5、Ascl2）共表达。
>谱系追踪显示，Prox1+细胞有助于隐窝动态平衡和再生
1. 单细胞转录组测序探讨肠道干细胞（ISC）之间的内在联系
层次聚类分析显示可将细胞分为2个亚类（cluster），Cluster 1 主要包括Lgr5hi 细胞，还有Cd166+, Cd24lo, Grp78-细胞。Cluster 2 由Bmi1-GFP+ 和 mTert-GFP+ 细胞组成。Hopx+, Dclk1+, lower SP细胞处于Cluster 1和 Cluster 2的中间位置。Cluster 1表现出 cycling crypt-based columnar cells (CBCs)的特征，包括Lgr5, Ascl2, Olfm4, Cd44, Sox9, Znrf3, Tnfrsf19。GSEA分析显示Cluster 1主要参与发育和离子运输过程。
图1 ISC群体的层次聚类
2. Cluster 2是由Bmi1-GFP+ 和 mTert-GFP+ 细胞组成，均具有肠内分泌细胞 (EE) 的特征。
mTert-GFP细胞中差异基因有Chga, Ghrl, Gip, Reg4，基因集太小不能进行GSEA分析，而在Bmi1-GFP+细胞中有840个差异基因。在Bmi1-GFP+ 细胞中EE分泌因子和EE转录因子基因高表达，而Cluster 1 CBC特征基因（Lgr5, Ascl2, Olfm4）则低表达。90% Bmi1-GFP+细胞与EE分泌因子基因 ChgA 共定位。 Bmi1+细胞中表达的EE基因就是EE标志物，同样在Dll1+和label-retaining cells（LRC）损伤诱导的ISC群体中可检测到。 Bmi1+和LRC 转录组结果显示确实有一些共有基因—Gip,Pax6, Rfx6, Peg3, Chga, Chgb。Bmi1-GFP+ 细胞显示出长时间的无性生长，具有干细胞/祖细胞潜能。
图2 Bmi1/mTert ISC集群的特征描述
3. 单细胞转录组测序显示Prox1 在大多数小的肠道内分泌细胞中表达，Prox1蛋白在74%的Bmi1-GFP+ 细胞中都能检测到。
从小鼠分离的Prox1-GFP+ 细胞可长成类似于肠的形状，与Bmi1-GFP+ 细胞相似。在Prox1-GFP; Prox1-CreER; Rosa26-tdTomato标记的小鼠中，它莫西芬处理36h后，一部分隐窝会出现1-2个Prox1+上皮细胞，分散在绒毛中。对它莫西芬处理的Prox1-CreER; Rosa26-tdTomato小鼠进行持续追踪，发现从9到395天一直能观察到 Prox1+ 细胞，说明隐窝基部的Prox1+ 细胞具有增殖潜能。另外，还发生了多谱系分化，包括enterocytes，goblet cells，EE cells，Paneth cells。Bmi1+ ISCs具有辐射和损伤诱导的增殖潜能，作者进行辐射实验发现Prox1+ ISCs 也具有再生能力，说明Prox1+ 和Bmi1+肠道上皮细胞有相似的功能。
图3 Bmi1-GFP+和Prox1+细胞在体内具有功能相似性
4. 作者从小鼠中分离 >1,000 Prox1-GFP+ 细胞，共获得1051个细胞，分成6个群体。
Clusters 0–3代表tuft 细胞，marker基因Dclk1 和Trpm5共表达。Cluster 4代表分泌的EE细胞， EE marker 高表达。
图4 Prox1-GFP+细胞的单细胞转录组
5. 探索 Prox1+细胞的特性及与Bmi1- 和Lgr5-细胞的重叠程度
作者比较1607个FACS分离的Lgr5-eGFP+细胞，658个隐窝Bmi1-GFP+ 细胞，246个Prox1-GFP+ 细胞和1010个 Lgr5-eGFP-肠上皮细胞，通过PCA分成13个cluster。Prox1-GFP+ 或 Bmi1-GFP+细胞与Lgr5-eGFP+细胞没有明显的重叠。>92% 的Bmi1-GFP+ 细胞表达EE分泌标志物-Chga, Chgb, Cck, Sct, Gip, Glp-1, Pyy, Nts，说明该细胞的主要身份是EE谱系细胞。Bmi1-GFP+ 细胞分成5个不同的EE亚群-Clusters 3, 6, 7, 10, 12，虽然有重叠但在5个亚群中EE分泌标志物的表达还是有差异的，比如Sct 和 Chgb在5个亚群中均高表达，而Chga, Gip, Tac1, Tph1, Sst, Nts, Reg4,Cck 在5个亚群的表达存在差异，反映了已知的EE细胞具有异质性。Prox1-GFP+ 细胞被分成2个主要的亚群，~52% 的 Prox1-GFP+细胞与Cluster 3重合，EE marker基因（Cck, Neurod1, Nts）在Prox1-GFP+细胞中高表达。剩余的Prox1-GFP+细胞属于Cluster 8，与tuft cells表达谱一致。
图5 在单细胞分辨率下Prox1-GFP+, Bmi1-GFP+, and Lgr5-eGFP+细胞间的直接比较
6. 对Bmi1-GFP+ 和Prox1-GFP+细胞进行 SPADE (Spanning Tree Progression of Density- normalized Events)分析来推测肠道发育轨迹。
图6 SPADE单细胞基因表达谱分析揭示Prox1-GFP和Bmi1-GFP细胞集群间的关联
Intestinal Enteroendocrine Lineage Cells Possess Homeostatic and Injury-Inducible Stem Cell Activity（Cell Stem Cell, 2017）
