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全球首篇！10x Genomics FFPE空间转录组文章出炉啦！
发布日期：2022-04-01浏览：
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本文转载自：仁科生物微信公众号(ID:bio-star)
10x Genomics 的Visium FFPE 空间转录组自2021年5月推出以来，很多研究FFPE样本的科学家踊跃开展实验，这不到一年的时间，全球首篇FFPE空间转录组的文章就发表啦，真是可喜可贺！今天，小编就为您分享一下这篇大作！
文章题目：Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer
发表时间：2022年3月
发表期刊：Immunity
影响因子：31.428
发表单位：法国索邦大学Cordeliers研究院
自身免疫性疾病、慢性感染、移植物排斥和癌症中长期炎症和抗原持久性的组织中存在三级淋巴结构（TLS）。肿瘤内的TLS与愈后是否良好相关。TLS是在成纤维细胞网络上形成的淋巴聚集体，包括一个T细胞区，以及一个B细胞区。成熟的TLS存在一个中心（GC），其中包含T滤泡辅助（Tfh）细胞和与B细胞密切接触的滤泡树突状细胞。一些研究表明，含GC的成熟TLS，与临床预后有关。这在肝细胞癌、肺鳞状细胞癌、结直肠癌和胰癌中都有验证。本研究针对ccRCC原发性肿瘤，作者做了12个冷冻切片空间转录组和12个FFPE切片空间转录组并结合BCR分析、多色免疫荧光等分析，发现肿瘤中的三级淋巴结构产生成熟B细胞，血浆细胞扩散到肿瘤基部中，产生抗体与肿瘤细胞结合并引发其凋亡。
研究结果
1.空间肿瘤微环境揭示了TLS+肿瘤中富含B细胞的相关区域
为了分析TLS对肿瘤微环境影响，作者使用了来自10x的Visium空间转录组学技术。本研究对12个冰冻和12个石蜡包埋的 ccRCC原发性肿瘤切片进行了空间转录组检测。在对切片进行H&E染色后，病理学家注释了每个肿瘤组织以及TLS的定位。
下图展示的是一个TLS Positive冷冻肿瘤、一个TLS Positive FFPE肿瘤和一个TLS negative冷冻肿瘤。碳酸酐酶9（蛋白质名称：CAIX，基因名称：Ca9）是ccRCC肿瘤细胞的标志物，在肿瘤切片中均匀分布。如下图所示，TLS+肿瘤中，B细胞谱系和T细胞基因在TLS区域内优先表达。与肿瘤组织的其他部分相比，TLS区域的B谱系和T细胞评分分布更高。TLS的单核细胞谱系略高，而NK细胞在整个肿瘤切片中分布更广。内皮细胞和中性粒细胞分布均匀，而纤维细胞在TLS区域的高表达。TLS与B谱系、T细胞和成纤维细胞特征的表达有关。
图1 肿瘤微环境中免疫细胞和基质细胞群的空间转录组学结果
2.TLS内部和外部的免疫球蛋白（Ig）基因表达
为了确定TLS在肿瘤中的转录情况，在根据HE的结果定义TLS后，作者在TLS肿瘤区域之间进行了差异基因表达分析。在与Ig基因（IGKC、JCHAIN）、IGG1和IGHA1基因相同的位置发现了成纤维细胞标志物COL1A1的高表达。作者分析了CXCL12的表达。总体而言，作者总结了在TLS+肿瘤中，表达PC的IGG1和IGHA1预先转移到TLS附近，并可能与成纤维细胞一起在肿瘤内传播。
3.空间B细胞受体（BCR）分析可识别原位超突变和克隆选择
TLS中B细胞成熟亚型和PC的共定位暗示了原位B细胞适应免疫而产生。在这种过程中，B细胞发生了突变细胞受体序列，并选择和扩展大多数克隆。
作者研究BCR的核苷酸序列。因为Visium冰冻切片空间技术是基于Bracode的RNA测序，这使作者能够查询原始转录物并进行空间BCR分析。作者使用MiXCR工具从Bulk水平5’RNA测序和3’ FF Visium 数据中识别BCR IgL和IgH克隆型及其种系超突变，捕获大多数IGL和一些IGH序列的完整CDR3区域。
图2 空间BCR剖析识别肿瘤区突变和克隆扩增和传播
研究发现，在TLS外的区域，大多是高度突变序列。尽管如此，在TLS内区域测量了包括高度突变序列在内的所有突变，而TLS外区域的大多数Ig转录物都富含高度突变序列，这表明细胞超突变发生在TLS中，并表明突变PC在整个肿瘤中传播。
作者检查了47个ccRCC肿瘤（包括由Visium的12个冷冻肿瘤）中bulk水平5’RNA序列的轻链和重链突变。为了确定细胞超突变是否伴有克隆型选择，作者研究了大量bulk 水平5’ RNA-seq数据的IgH。高TLS的样本表现出高总克隆数，同时超过100倍的克隆类型数比例更高。
最后，为了确定扩增IgH克隆型的克隆关系和位置，作者对30个RNA-seq空间数据进行了克隆性评估。作者证明了相应的B细胞克隆的迁移。在TLS低样本中，检测到的克隆类型数量非常低，这也支持了肿瘤内PC主要在TLS中生成的命题。
图3 PC与成纤维细胞和IgG肿瘤染色在TLS+肿瘤中的共定位
总而言之，这些数据支持原位TLS介导的成熟发育、选择、克隆扩增过程，并且在肿瘤的各个区域传播PC细胞。
4.血浆细胞沿着成纤维细胞轨迹从TLS传播
为了分析肿瘤内PC和成纤维细胞的位置以及CXCL12的原位表达，作者使用了FFPE肿瘤切片多色荧光标记，多发性骨髓瘤癌基因1（MUM1）（IRF4）作为PC的特定标记， COL1（Col1a）作为成纤维的特定标记。
这些数据概括了Ig和成纤维细胞转录物的共同表达，以及成纤维细胞转录物和CXCL12的共同表达，并验证了PC在TLS内和空间转录组学确定的成纤维细胞网状细胞轨迹中的位置。
5.TLS和Ig产生PC与凋亡肿瘤细胞结合的IgG抗体有关，并对免疫治疗有反应
为了进一步研究TLS、肿瘤内PC和Ig的联系，作者首先分析了TLS的成熟度。成熟的TLS特征是GC包含B细胞区，周围是T细胞区，其中CD4+PD1+ T细胞、CD4+ PD1+CXCR5+ Tfh细胞和产生CXCL13的细胞被检测到（如下图）。
图4 成熟的TLS+肿瘤显示有更多的MUM1+ PC
作者进一步研究了TLS成熟度标记与57个TLS+样品上MUM1+IgG+和MUM1+IgA+ PC密度的相关性。作者发现TLS具有CD23+ FDC、BCL6+细胞和PNAd+ HEV与MUM1+IgG+ PC和MUM1+IgA+ PC密度之间存在很强的相关性。结合抗人类IgG在TLS+肿瘤中被观察到，而在TLS肿瘤中没有观察到。对103个肿瘤的量化显示，IgG阳性率很高，与TLS肿瘤相比，TLS+的肿瘤细胞高达100%。在TLS+和TLS中都观察到弱IgA（如下图）。
图5 与未成熟或没有TLS的肿瘤相比，有TLS肿瘤的IgG+
CAIX+肿瘤细胞增加。这与肿瘤细胞死亡和对ICI的反应有关
为了揭示肿瘤结合的IgG抗体的潜在功能，作者调查了肿瘤细胞中发生凋亡的迹象，凋亡细胞数量高，IgG肿瘤细胞比例很高。
为了评估IgG肿瘤对ICI治疗患者的影响，作者评估了患者的35个NI治疗的肿瘤患者和16个Nivolumab治疗的肿瘤患者。与低IgG肿瘤细胞患者相比，高IgG肿瘤细胞患者的PFS要长得多。
总结
肿瘤的三级淋巴结构（TLS）会影响癌症免疫治疗的效果。作者使用空间转录组学来说明肾细胞癌（RCC）TLS中B细胞的反应。B细胞在TLS中富集，Visium可以识别B细胞向血浆细胞（PC）转化过程中的所有阶段。分析B细胞揭示TLS中的克隆多样化、选择、扩增等过程，并且发现远端存在完全成熟的克隆类型。
在TLS+肿瘤中，产生IgG和IgA的PC沿着成纤维细胞轨迹传播到肿瘤基部。TLS+肿瘤中产生了较多的IgG转化来的PC、IgG以及凋亡恶性细胞，这表明抗肿瘤效应的活性。免疫治疗反应相关的B细胞成熟和抗体产生的过程发生在肿瘤中的TLS，TLS可能具有抗肿瘤作用。这为肿瘤治疗提供了全新的思路。
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