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文章的题目，是《In vivo CRISPR screens identify the E3 ligase Cop1 as a modulator of macrophage infiltration and cancer immunotherapy targetn》

这篇文章，发表在Cell杂志2021年10月刊上

文章的题目翻译成中文，意思是《体内 CRISPR 筛选确定 E3 连接酶 Cop1 作为巨噬细胞浸润的调节剂和癌症免疫治疗的靶标》

文章的通讯作者，名字叫刘小乐，她是美国，波士顿 Dana Farber癌症研究所的研究人员。同时，刘小乐是上海同济大学的客座教授

实验内容的第一部分，大规模体内 CRISPR 筛选确定免疫逃避的调节剂

为了系统地发现：癌细胞中发生丢失，就会增强抗肿瘤免疫力的基因靶标，作者首先构建了一个鼠的慢病毒 CRISPR-Cas9 敲除文库，这个文库的英文名缩写是 MusCK.

这个文库针对4500多个与肿瘤起始、进展和免疫调节有关的基因，对每个基因有5个 sgRNA.

图中，是这些基因的分布情况。

为了验证 MusCK 文库的质量，作者在体外将这个文库转导到小鼠 4T1 细胞中。

从图中，我们可以看到细胞被转染之后，有表达 Cas9 的蛋白。

4T1 细胞是一种与人类的三阴性乳腺癌细胞很相似的细胞系。可移植到同基因背景的 BALB/c 小鼠中，并已经被广泛地应用于肿瘤免疫学研究。

作者把用文库转染后新鲜的细胞与转染后传了10代的细胞中的sgRNA丰度分布做分析，

发现，含有靶向到已知致癌基因的 sgRNA 的细胞显著减少

含有靶向到已知肿瘤抑制基因的 sgRNA 的细胞显著富集

这支持了MusCK 库的可靠性

接着，把几种卵清蛋白基因，也就是ovalbumin基因，转染进4T1细胞。

再把这些细胞移植到小鼠身上。

人工地让这些细胞表达ovalbumin基因，是一个广泛被使用的，在同种小鼠的肿瘤模型中，增加免疫反应的通用方法。

从这个western blot的图中，可以看到Ovalbumin的表达

细胞分别被4种卵清蛋白基因转染后，被转染的细胞都被检测到有表达卵清蛋白。

肿瘤移植的结果如作者所预期的那样，表达膜结合的卵清蛋白的这个肿瘤，生长最慢，

膜结合的卵清蛋白加强了动物模型的免疫反应。

然后作者将慢病毒 MusCK 文库转导到表达膜结合卵清蛋白的 4T1 细胞中，并将受感染的细胞植入三种小鼠宿主的乳腺脂肪垫中

这三种小鼠宿主，分别是Foxn1 基因缺失的小鼠，也就是裸鼠、 正常的小鼠，和事先接种卵清蛋白进行了预先免疫的小鼠

每一种小鼠，都用12只小鼠做实验

并为每只小鼠注射足够的细胞，以实现 MusCK 库中所有 sgRNA 的 200 倍覆盖率。

在做了细胞移植后的16天，回收种在小鼠身上的肿瘤细胞，并进行分析。

这是种在小鼠身上的肿瘤的体积。

可以看到，没有Foxn1基因的裸鼠身上，肿瘤的体积长得最大。

而通过卵清蛋白预先免疫的小鼠身上，肿瘤体积最小。

种在普通小鼠身上的肿瘤，它的体积介于上述两者之间。

为了分析 sgRNA 库的 CRISPR 扫描的结果，作者分析了各种种在小鼠体内的肿瘤细胞中的sgRNA的分布情况。

这张图是分布的关键成份图。

可以看到，先是体外培养的细胞，区别于体内培养的细胞，它们之间有一个区分

然后，是体内培养的细胞，按照宿主小鼠，是免疫缺失的裸鼠，还是有免疫力的小鼠，也各有一个区分。

这是MusCK 筛选中，在免疫活性宿主与免疫缺陷宿主中，sgRNA减少最多的基因。

作为阳性对照，针对 Cd274 的 sgRNA，在种在野生型小鼠的肿瘤细胞中大幅度减少。

而Cd274就是大名鼎鼎的 PD-l1 的别名。

另外，DNA修复路径中的关键元素，Brca2和Pms2，在野生小鼠中是被显著地负向选择的。

这与之前的报道，说到基因组不稳定、或者突变负担高的肿瘤细胞，更容易被T细胞介导的杀死，是一致的。

有趣的是，干扰素gamma通路上的关键元素，在野生小鼠上是显著减少的。

这提示干扰素gamma，在肿瘤细胞中，可以抑制免疫逃逸。

干扰素gamma是一种由肿瘤浸润淋巴细胞分泌的细胞因子，可引发抗肿瘤免疫反应

RNA-seq 显示，（gamma 干扰素）IFNγ 信号在肿瘤中有活性，而在体外培养的细胞中没有活性

作者为了证实他的这项发现，进行了一项竞争测定，以评估缺乏 gamma 干扰素信号传导的 4T1 细胞在体内生长.

针对 Jak1 和 Stat1 分别做sgRNA，组装进带红色荧光蛋白基因的质粒载体，

针对Rosa26的sgRNA，组装进带绿色荧光蛋白基因的质粒载体，

把两种质粒以50:50的比例混合，转染肿瘤细胞，

然后把肿瘤细胞移植到两种小鼠身上，这两种小鼠，分别是没有免疫力的裸鼠，和有免疫力的正常小鼠。

流式细胞仪的分析发现，

Jak1 或 Stat1 敲除的肿瘤细胞比例明显低于对照组，尤其是在野生型的小鼠身上是这样。

而且在用 EMT6 细胞做的实验中 ，Jak1 或 Stat1 被敲除的细胞也是一样有减少，这进一步证实了，在三阴性乳腺癌中，gamma 干扰素的信号通路在抑制肿瘤中的作用。

实验内容的第二部分，Cop1 的缺失使癌症对免疫疗法敏感

作者为了提高体内 CRISPR 筛选的稳健性，构建了第二个文库，也就是 MusCK 2.0 文库，专注于在初级筛选中确定的 79 个候选基因，每个基因有 8 个 sgRNA。

这些文库转染表达膜结合卵清蛋白的4T1细胞。

再把转染后的细胞移植到四种小鼠身上。

这四种小鼠，分别是：

1、免疫缺陷的裸鼠

2、野生型小鼠

3、用卵清蛋白预先免疫过的小鼠

4、用卵清蛋白预先免疫过，又用抗PD-1单克隆抗体处理过的小鼠

其中第四组分组，特别加入针对PD1的抗体，目的是要通过对PD-1/PD-L1这个通路的阻断，来研究它针对特定免疫原的T细胞免疫的影响。

这两张图，是测量四种小鼠身上的种的肿瘤的体积。

左图是在种肿瘤细胞后第4天，看到的结果。

右图是在种肿瘤细胞后第16天，测量到的结果。

可以明显地看到，在第16天，四组小鼠身上的肿瘤的大小，相互之间存在显著的差异。

整体上，免疫力越强的小鼠，它身上的肿瘤体积就越小

用了抗PD1抗体的小鼠，它身上的肿瘤体积是最小的。

作者还观察到在这四组中相对于总的肿瘤免疫浸润，

T 细胞浸润逐渐升高

这其中，T细胞浸润，是用TCR beta +来体现的

而总肿瘤免疫浸润，是用Cd45.2来体现的。

在野生型小鼠宿主中，也就是第2组到第4组小鼠宿主中，一般预计有效免疫反应所需的基因会耗尽。

事实上，作者观察到已知的免疫逃避介质（Cd274/Pd-l1）显著减少，

并且 gamma 干扰素信号通路的成分（Jak1、Jak2、Stat1 和 Irf1）也显著减少。

作者还观察到实验室先前在前列腺癌中发现的Trim24减少、E3 泛素连接酶 Cop1等的致癌转录激活因子的减少。

在另一个小鼠的三阴性乳腺癌细胞 EMT6 的动物模型中，也观察到了相同的表型，

就是针对 Cop1 和 Trim24 这两个基因的 sgRNA 在野生型动物模型中的减少。

在另一个小鼠的结直肠癌细胞 MC38 的动物模型中，

也观察到了同样的现象，就是针对 Cop1 的 sgRNA 在野生型动物模型中的减少。

这是针对 Cop1 的 sgRNA 在2种肿瘤细胞的动物模型中的频率。

我们可以清楚地看到，Cop1在裸鼠中，输入量与被检出频率之间，并没有显著的差异

而在三个野生小鼠动物模型上，都看以看到有显著的减少。

这是在在 4T1 的动物模型中，靶向到 Cop1 的单个 sgRNA 数量。

我们可以明显地看到，左侧灰色的裸鼠身上的针对Cop1的sgRNA数量，明显地高于其它三种颜色代表的野生小鼠身上针对Cop1的sgRNA的数量。

尽管在体外与对照组的 Rosa26 KO 细胞相比，Cop1 KO 细胞没有降低存活率，

但是作者观察到，在无论有和没有抗 PD-1 治疗的野生型 BALB/c 宿主中，Cop1 KO 三阴性乳腺癌细胞的体内肿瘤进展都显著减慢

这是Kaplan-Meier 生存分析图，图中显示，

与裸鼠相比，被移植了Cop1敲除的肿瘤细胞的野生型小鼠，无论有或没有抗 PD-1 治疗，生存期都更长。

在免疫活性 C57BL/6 为宿主的 MC38 癌细胞的结直肠癌模型中，细胞中的 Cop1 KO 也能够显着降低肿瘤生长，并延长小鼠存活期

在图中，我们可以看到Cop1 KO 之后，肿瘤细胞的体积比对照组长得小

并且，KO之后，小鼠活得更长。

值得注意的是，Cop1 KO 的细胞，移植到受到抗 PD-1 处理的小鼠中之后，

一方面肿瘤被清除，

另一方面小鼠能够100%活满60天。

这样，Cop1 KO 在 MC38 结直肠癌基因模型中的作用表明，Cop1 抑制，通过一种可能适用于三阴性乳腺癌以外的其他癌症类型的机制，来增强抗肿瘤免疫

实验内容的第三部分，Cop1 KO 通过调节巨噬细胞相关趋化因子来减少巨噬细胞浸润

在2000年，Osterlund等科学家就发现，

Cop1这个基因，会在拟南芥中，导致目标蛋白降解。

之后，科学家又发现Cop1会介导降解抑癌蛋白TP53，转录调节因子c-Jun，和代谢调节因子Torc2.

在人类的基因组中，Cop1基因是在1号染色体上，而且Cop1在的这一段染色体经常在乳腺癌病人中有拷贝数增加。

接下来，作者做了在gamma干扰素处理下，4T1 细胞中 Cop1 基因被KO的实验，

对照组是别的条件一样，但Cop1基因没有被KO的细胞

然后用RNA-seq 来分析两者的RNA表达的差异。

结验结果发现，Cop1 被KO的细胞，有754个基因的表达明显上调，有1303个基因的表达明显下调。

基因集分析表明，下调的基因，集中在免疫调节通路

包括：

肿瘤死亡因子 alpha 通路，

免疫反应，

JAK-STAT 信号通路，

细胞趋化因子、

细胞因子信号活性，

这些基因集。

并且，在没有gamma干扰素处理的细胞中，得出同样结论，下调的基因也是集中在这些基因集中

4T1细胞的Cop1 被 KO，会导致细胞中：

对巨噬细胞的化学吸引物

参与巨噬细胞活化的细胞因子

和 TNF 受体超家族成员

这些基因的显著下调

这是对Cop1 KO 与没 KO 细胞，做96个细胞因子的蛋白的定量检测结果。

图中，横轴是没有KO的细胞的蛋白量，纵轴是有KO的细胞的蛋白量。

可以看到这96个蛋白，大多数都落在了对角线的下方，也就是这些蛋白在KO细胞中的含量，少于在没有KO的细胞中的含量。

可以确认，这一系列用红点子标示出来的细胞因子都有显著的下调。

这是用流式细胞方法检测浸润到肿瘤中的巨噬细胞的数量，

可以看到Cop1 KO的肿瘤动物模型中，浸润到肿瘤中的巨噬细胞数量，

明显比对照组的要少。

相比之下，在Cop1 KO的动物模型的肿瘤中，

CD8+ T细胞、

髓系细胞、

单核细胞

都没有明显减少

作者进一步做实验，用蛋白芯片和bulk RNA-seq对肿瘤组织进行蛋白和RNA的分析，都发现在Cop1 KO的模型中，巨噬细胞趋化剂减少。

这里，上面的图是蛋白芯片的结果，可以看到几个被关注的巨噬细胞趋化剂的蛋白质，都在KO模型中减少。

下图，是RNA-seq的结果，也可以看到这些趋化剂的RNA的表达量下降。

为了进一步搞清是巨噬细胞中的哪个亚群，在Cop1 KO之后发生了改变。作者进一步做了单细胞RNA-seq。

这是得到的单细胞UMAP图。

对单细胞进行分析，可以看到，在Cop1 KO的模型中，

M2 巨噬细胞对肿瘤的浸润减少，

而M1 巨噬细胞对肿瘤的浸润增加。

更进一步，肿瘤中浸润的巨噬细胞占Cd45+ T细胞的占比，与肿瘤的体积成正相关。

而T细胞在CD45+ 细胞中的占比，与肿瘤体积成负相关。

这个结果，提示三阴性乳腺癌中的 Cop1 调节肿瘤微环境中的巨噬细胞趋化性，抑制 Cop1 可减少肿瘤巨噬细胞浸润，从而抑制肿瘤进展并提高存活率

实验内容的第四部分，综合分析将 C/ebpδ 鉴定为 Cop1 的特定蛋白质底物

接着，作者想要寻找 Cop1 的底物。

因为大多数的已知的 Cop1 的底物是转录因子，因此，作者推理对Cop1做基因敲除，会稳定那些压制巨噬细胞的细胞因子表达的转录因子。

作者推测当 Cop1 被敲除后，要找的转录因子的表达变会发生改变。

作者用 LISA 方法，从Cistrome数据库中推算 Cop1 的底物。

Cistrome数据库，是一个顺式调控因子数据库。

给定一组差异表达的基因，LISA 首先从 Cistrome 数据库中的大量公开组蛋白标记和染色质可及性概况中估计拟合这些输入基因的表观遗传模型，然后使用转录因子染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq) 结果，和已知推断驱动调节因子的 DNA 结合基序

对 Cop1 KO 下调基因的 LISA 分析表明，CEBP 和 AP-1 家族的转录因子是推定的调节因子

尽管尚未有报道 CEBP 家族的转录抑制功能，但已知 AP-1 家族可抑制基因转录

作者对 Cop1 KO 的样本，做了ATAC-seq的分析。

结果发现，在大多数的peak中，Cop1 KO没有造成大的改变。

在Cop1 KO的样本中，上调的峰，更多一些。

与公共 ChIP-seq 数据对基序富集和峰重叠的分析发现， Cop1 KO 特异性上调与 AP-1、CEBP 和 ETS 家族的转录因子相结合的峰被富集，

因此，ATAC-seq 数据支持 RNA-seq 分析将 AP-1 和 CEBP 家族的转录因子作为 4T1 细胞中 Cop1 的推定底物。

为了进一步验证 Cop1 蛋白质降解的底物，作者使用质谱法来鉴定与对照细胞相比，Cop1 KO 4T1 细胞中丰度增加的蛋白质

在检测到的 7,000 多个蛋白质中，ETS、AP-1 和 CEBP 转录因子家族的几个成员显著上调

为了排除次生效应导致非蛋白酶体降解的可能性，作者在用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理细胞后进行了额外的蛋白质组学分析。

在 CEBP 转录因子家族的蛋白质中，只有 C/ebp delta 在 MG132 处理下显示出 Cop1 依赖性蛋白质降解

接下来，这个C/ebp delta基因还会多次出现，为方便讲解，将会将之简称为“delta”。

为了进一步评估 delta 对小鼠三阴性乳腺癌模型中 Cop1 功能丧失后肿瘤进展的影响，作者将仅含有 Cop1 KO 的 4T1 细胞或含有 Cop1 和 delta KO 的 4T1 细胞植入小鼠。

观察到4T1细胞的肿瘤生长，会因为Cop1的KO而减慢，

Cop1 KO 4T1 细胞，再做了delta KO后，肿瘤生长的速度恢复到和原来的肿瘤一样的生长速度。

这表明 Cop1 功能障碍诱导的 delta积累，是抑制 4T1 肿瘤生长的原因。

这些结果提供的证据表明，在 4T1 细胞中，delta是 Cop1 的特定蛋白质底物，它介导染色质可及性增加、靶基因表达降低和 Cop1 KO 后肿瘤生长减慢。

实验内容的第五部分，delta 抑制癌细胞中巨噬细胞吸引趋化因子编码基因的表达

为了绘制 delta 结合位点和靶基因，作者在有或没有 Cop1 KO 的 4T1 细胞中进行了 delta 的 ChIP-seq 实验。

实验结果，与 Cop1 KO 后 delta蛋白丰度增加一致，总体上有更多上调的 delta结合峰

相应的染色质可及性更高

基序分析发现

CEBP 基序是上调的 delta 可及性峰中最丰富的基序，

而 AP-1 家族成员 Fos 基序在下调的 delta的可及性峰中最为丰富。

这表明上调的 delta 峰是 Cop1 KO 对 delta的主要影响。

为了评估 4T1 癌细胞中哪些基因集受 delta 调控，作者通过 Cistrome-GO 评估了 Cop1 KO 上 delta 结合位点附近的差异表达基因，

Cistrome-GO 是作者之前开发的一种算法，用于对 ChIP-seq 和 RNA-seq 数据进行分析。

作者发现下调的基因与免疫反应基因和巨噬细胞趋化因子的调节显著相关，例如 Ccl2 和 Ccl7。

Cop1 KO 下调的通路在 delta KO 中上调

为了进一步评估 delta 对免疫反应基因和巨噬细胞趋化因子的转录作用，对 delta KO 进行了 RNA-seq 分析。

结果证实，与 Cop1 KO 相比，delta 的 KO 对细胞因子和细胞因子受体的调节具有相反的影响，尤其是 4T1 细胞中的巨噬细胞相关细胞因子

为了评估 Cop1 对小鼠三阴性乳腺癌模型中巨噬细胞浸润和肿瘤进展的影响是否与人类肿瘤相关，

作者检查了公共肿瘤队列。与癌症基因组图谱（TCGA）中的许多癌症类型（包括乳腺癌和结肠癌）中的相邻正常样本相比，COP1 在肿瘤样本中的表达更高。

此外，COP1 表达与先前研究推断的 M2 巨噬细胞特征呈正相关，而 delta 表达与 M2 巨噬细胞特征呈负相关

实验内容的第六部分，Cop1 通过支架蛋白 Trib2 靶向 delta 进行蛋白酶体降解

作者用计算机软件，通过Cop1降解的目标肽段序列数据库，来计算Cop1和 delta 蛋白的相互作用关系，计算结果显示两者没有直接关系，这让作者感到吃惊。

作者接着根据文献，发现Trib2 可以作为Cop1与底物之间的适配器，

作者接着假设 Trib2 可能作为一个适配器来促进 delta 和 Cop1 之间的相互作用，导致 Cop1 介导的 delta 蛋白酶体降解

设想的情况如图所示。

为了验证这一假设，作者首先在野生型 4T1 细胞中进行了免疫共沉淀 (coIP)。

这证实了内源性 Cop1、Trib2 和 delta 的共同结合

为了证实 delta 降解是由蛋白酶体途径介导的，作者用选择性蛋白酶体抑制剂 MG132 处理了 4T1 细胞。

观察到，在蛋白酶体被抑制的情况下，无论 Cop1 状态如何，Trib2 和 delta 蛋白的含量都明显高于野生型细胞

为了证明 Trib2 在介导 delta 的 Cop1 降解中很重要，

作者使用 CRISPR 来敲除 Trib2。

这不仅破坏了 Cop1 和 delta 之间的相互作用，

而且还增加了 delta 蛋白的水平

这些结果表明，在 4T1 癌细胞中，delta 是 Cop1 的底物，

并且 Cop1 和 delta 之间的相互作用，是由 Trib2 介导的，

这导致 delta 的泛素化和蛋白酶体降解