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实验内容的第1部分，TraCe-seq 平台的建立

这是TraCe-seq和原理。

一群细胞，这群细胞中的每一小簇都被做了基因标记。这些基因标记，可以在将来被用作确认哪个细胞是属于哪个细胞簇的。

然后，这些细胞群被各种处理方法所处理。要用回推方法，来找出不同治疗方法的疗效和作用机理的综合比较

被不同方法处理过的细胞，其中不同的细胞簇会有不同的存留，比对特定治疗处理的细胞的适应过程

接下来，对这些不同的细胞簇做单细胞RNA-seq，分析其中的各个细胞亚群或细胞克隆的表达水平。

这是用来转染进细胞的载体的结构，实验中会将这载体转当进细胞，这个载体会整合进宿主的基因组，在后面会用作跟踪细胞的标签。

这段基因，可以转录出mRNA，与10x的单细胞测序流程可以匹配，将来可以用单细胞测序来进行跟踪。

这里，N30是30个碱基，这30个碱基的序列，大体上是随机的，但是在GC含量的平衡上做了一些调整，以保证GC含量的平衡。这30个碱基，带来了10万种变化，有了这10万种变化，后面就可以跟踪那个细胞是来自于哪个亚簇了。

N8，是用来区分文库的序列。也就是可以把不同批次的样本，用不同的N8序列来标示，这样就可以分出不同批次的文库。

eGFP则是一个编码荧光蛋白的基因。

PuroR是一个抗嘌呤霉素的抗性基因，用于筛选出被这个质粒转染了的细胞。

作者为了确认TraCe-seq这个系统的跟踪性能，用5个细胞系，每个细胞系用一种独特的barcode的载体去转染，转染之后的细胞用嘌呤霉素进行筛选，也就是让有转染的细胞活下来，把没有被转染的细胞除掉。

活下来的细胞混合在一起，用10x的单细胞RNA测序进行分析。

图中，就这是些细胞的UMAP图。

左边的这图，是根据细胞的表达谱来确认细胞属于个哪个细胞系，

右边的这张图，是根据细胞上的barcode来确认细胞属于哪个细胞系。

我们可以看到，细胞分成了明显的5个簇，而且81%的细胞，都归属到了barcode所指定的细胞簇。

这是marker基因在5个细胞系的细胞中的表达。

左图，是bulk测序得到的结果。

右图，是单细胞测序得到的结果。

我们可以看到，右图中单细胞测序中得到的marker基因的表达情况，是和左图中bulk测序得到的结果是一致的。

这是5种细胞的各自的标志基因，分别在这5个细胞系的细胞中的表达。

我们可以看到，每个基因都在它标志性的细胞中有高表达。

接着，作者对被正确或者错误划分的细胞，分析它们的每个细胞被测到的reads数，

发现被正确划分的细胞，大多被测到了大量的reads，

而被错误划分的细胞，大多只被测到了少量的reads。

结合前面的分析结果，可以得出一个结论，就是TraCe-seq可以很好地跟踪细胞克隆在细胞群中的来龙去脉

实验内容的第2部分，与传统的 EGFR 激酶抑制剂相比，TraCe-seq 捕获了双重 EGFR 抑制剂-降解剂的较差的活性

这里列出了三个化合物，

其中厄洛替尼，是经典的EGFR的抑制剂，抑制EGFR的磷酸激酶活性。

GNE-104这个化合物，是从厄洛替尼衍生出来的化合物，它既有和厄洛替尼一样的抑制EGFR酶活性的作用，还有引导降解EGFR的作用。

从化学结构上看，可以看到GNE-104的左侧，与厄洛替尼的化学结构几乎完全一致。中间通过两个炔键，连到右边的化学结构，文章用把这右边的结构称作von Hippel–Lindau-binding moiety,简称VHL结构部分。

再看GNE-069这个化合物。它与GNE-104只差一个手性碳。从图可以看到，104的这个羟基，是指向纸面的后方的，而069的这个羟基，是指向纸面的前方的。

069这个化合物，它是EGFR的抑制剂，但不是EGFR的降解剂，放在这里，作为104的对照。

作者要搞清 TraCe-seq 能不能解决三个问题

1.在用一种特定的化学分子处理细胞后，能否区分对药物敏感的细胞克隆，和抗性的细胞克隆

2.抓到已知的与 EGFR 抑制剂抗性相关的基因

3.区分对 EGFR 降解剂的反应和抗性的机理，比照传统的EGFR 激酶抑制剂

为了对是否能够高度重复地抓取到细胞应对抑制剂的各种表型的表达谱，作者把500个用TraCe-seq做了标签的PC9细胞系的细胞克隆，混合成一个细胞池，

再分别用厄洛替尼与GNE-104进行处理2个月。

然后用测序的方法对细胞进行分析。

图中展示了分析的结果。

这是一张热图，图中，从左到右排列的是500个细胞克隆。

从上到下，排列的是3组样本，这三组样本分别被厄洛替尼、GNE-104、或者DMSO处理。

线条的颜色，则显示了每个克隆被测到的reads数，reads数越多，线条越偏棕红色。

可以看到，被厄洛替尼和GNE-104处理的两组细胞的各clone的reads数，有高度的一致性。

这让作者有信心，可以抓到对EGFR有反应的、或对EGFR有抗性的克隆的表达谱。

接下来，作者要搞清楚，在培养的第几天进行取样是合适的。

作者用四种培养条件，试了一共8天。

这四种培养条件，分别是：DMSO、厄洛替尼、GNE-069、和GNE-104，

图D，展示了在各个培养条件下，细胞的生长情况。

最后，作者决用在第4天进行取样。因为第4天已经显示出充分的抑制细胞生长的作用。

为了进行 TraCe-seq 实验，作者随机选择了 600 个带有独特条形码的 PC9 细胞，并将这些细胞扩大约 12 倍以建立起始群体

然后，在大约 30 倍的条形码覆盖率下对该群体的一小部分进行了单细胞转录分析，以记录基线转录程序和相对克隆丰度

然后在每个条件下接种 200,000 个这些细胞，并用厄洛替尼、GNE-104 或 GNE-069 处理它们

在第 4 天收集细胞并通过 10x scRNA-seq 进行分析以确定每个克隆的相对适合度并捕获治疗诱导的转录变化

为了确认 TraCe-seq 方法准确测量基线的相对克隆大小（从 TraCe-seq 条码丰度推断），在 DMSO 中将 20,000 个条码细胞扩增了 7 天，并通过对基因组 DNA 的条码分析（> 3,000 × 测序覆盖率）

可以看到，大多数的点，排列在斜对角的方向，也就是说，scRNA-seq 与基因组 DNA 分析确定的克隆丰度是高度相关的。

作者在治疗前在基线处恢复了 551 个条形码。

所有处理条件都导致条形码多样性降低 (-16.0 ± 5%），也就是经过药物处理，部分细胞克隆被杀光了

厄洛替尼和 GNE-069 治疗后的相对克隆丰度高度相似，反映了它们高度可比的活性，

而 GNE-104 治疗导致了更加不同的模式

与观察到的 GNE-104 生长抑制活性降低一致，

GNE-104 处理在减少 TraCe-seq 条形码的绝对数量和多样性方面效果较差（图 1e）

进一步看，三种药物，都让MAPK的表达受到抑制，相比于本底，都有显著性差异。

而厄洛替尼和GNE-069会导致相比于GNE-104，有更多的细胞被停滞在G0期。

接下来，作者又对几种细胞系做了实验，发现GNE-104对细胞生长的压制比较少。

而且，GNE-104的这种抑制功能的减少，不是因为VHL配体的存在而导致的。

作者做了VHL配体，和它的对映体的对照实验，发现实验的结果是一样的。

实验内容的第3部分，TraCe-seq 揭示了与传统 EGFR 激酶抑制剂相比，对双重 EGFR 抑制剂-降解剂的不同转录反应和耐药机制

接下来，为了进一步搞清楚PC9细胞的各个克隆，对药物处理的抗性反应，作者把细胞克隆按照抗性分了三类。

这里，蓝色的是只对激酶抑制剂有抗性的；黄色的是对降解反应有抗性的；而红色是对两种作用都有抗性的。

右边的图中，细胞克隆从左到右，按照刚才提的三种抗性的细胞克隆依次排列。

从上到下，则是没有被药物处理的对照组的细胞，和分别被三种药物处理的细胞。

图中，每一个小格子的颜色，则是对应于这个格子的细胞数量，颜色越偏黄，则细胞数越多。

在GNE-104处理的细胞中，有一个特别的、相比于激酶抑制处理的的细胞组，这些细胞被归类在对降解有抵抗作用的这一类里。

值得注意的是，我们发现降解剂抗性克隆仅显示 AXL 表达升高，但没有显示 VIM 上调，表明它们确实在转录上与激酶抑制剂抗性克隆不同（图 2b）

为了揭示哪些转录程序可以使细胞在降解剂处理下存活，进行了无偏见的基因集表达分析，将抗降解剂克隆与敏感克隆进行了比较。

发现“内质网中的蛋白质加工”活性是降解剂抗性克隆和降解剂敏感克隆之间的差异中，最重要和最富集的途径，表明 内质网蛋白加工基因表达较低的细胞可能受到保护来自 GNE-104。

为了进一步探索与激酶抑制剂或降解剂治疗抗性相关的适应性转录程序，作者通过伪时间系统地对处理过的细胞进行排序，以无监督的方式跟踪细胞状态进化，从而进行了轨迹推断分析。该分析确定了具有不同过程和命运的四个路径

激酶抑制剂敏感性与激酶抑制剂抗性克隆的分布表明路径 b 和 c 与激酶抑制剂抗性相关，而路径 d 代表敏感性

一致地，我们发现 VIM 表达沿路径 b 和 c 升高，代表对 EGFR 抑制的普遍抗性，

而 MAPK 通路活性评分受到最强烈的抑制，G0/静止细胞状态沿d路径升高最多,符合灵敏度。

与激酶抑制剂抗性克隆的分布相反，我们发现降解剂抗性克隆在路径 a 中最为普遍

此外，虽然这些克隆在 GNE-104 处理后显着分布在路径 a 的末端，但在激酶抑制剂处理后，它们在敏感轨迹--路径 d--中的存在增加。

值得注意的是，与 ER 途径中的蛋白质加工相关的基因沿着路径 a 被独特地下调，这表明 ER 蛋白加工基因的表达降低与这些细胞在 EGFR 降解剂下的治疗适应和存活独特相关。

实验内容的第4部分，对双重 EGFR 抑制剂-降解剂与传统激酶抑制剂的不同反应是由抑制剂结合的 EGFR 蛋白的持续存在介导的

对双重 EGFR 抑制剂-降解剂与传统激酶抑制剂的不同反应是由抑制剂结合的 EGFR 蛋白的持续存在介导的。

激酶抑制剂与降解剂治疗之间的明显区别是 EGFR 蛋白的持续存在。为了测试 EGFR 蛋白的存在是否解释了这些差异反应，作者使用短干扰 RNA (siRNA) 结合激酶抑制剂处理来消除 EGFR 蛋白的产生（扩展数据图 7a）。

这是受药物处理两天的总 EGFR 和磷酸化的 EGFR 的印迹分析。

我们可以到敲低作用，让EGFR蛋白的表达降低。

EGFR敲低还导致了强烈的MAPK通路抑制,

我们可以看到，在PC9和HCC4006这两种细胞中，

只有针对EGFR的siRNA，也就是绿色的这条线，还是比其它用了抑制剂药物的线，要更矮。

也就是说抑制剂的作用，还是强于siRNA的作用。

用 siEGFR 处理的细胞，会出乎意料地免受激酶抑制剂厄洛替尼和奥希替尼的治疗

这些结果进一步表明，EGFR 蛋白水平的降低可能会自相矛盾地阻碍 EGFR 激酶抑制剂的细胞功效。

为了进一步检验这一假设，作者基于与 VHL 结合配体连接的变构 EGFR 配体 EAI-045

生成了 EGFR 降解剂 GNE-641。

EAI-045是EGFR的配体，EAI-045能够与osimertinib（奥希替尼）共同结合到有L858R突变的EGFR蛋白上。

GNE-641是在EAI-045的基础上，再连上了VHL功能团。

用奥希替尼和641一起处理细胞，能够有效地降解EGFR蛋白。

另外，还有一个GNE-640，它和641只差了一个碳原子的手性。这个640分子对EGFR蛋白含量没有降解作用

这是GNE-641/640 结合奥希替尼处理细胞

可以看到641结合奥希替尼处理细胞，EGFR蛋白的含量是有降低的，

而640结合奥希替尼处理细胞，EGFR蛋白的含量是没有降低的

在奥希替尼处理后的细胞，GNE-641的处理，反而会让细胞多一些。

这些结果都强烈地显示EGFR蛋白本身在介导EGFR激酶抑制剂的效率方面，起到了关键性的作用。

这是内质网压力，到细胞死亡的信号传递轴。

具体来说，已知内质网蛋白质稳态的破坏，例如蛋白质错误折叠和分泌负担的增加，会增加内质网应激

当内质网压力超过某个阈值时，它会通过 ISR PERK-ATF4-CHOP 轴，引发有效的趋向细胞死亡信号

作者假设激酶抑制剂结合的 EGFR 蛋白的持续存，在可能导致激活内质网应激下游的趋向死亡的信号级联反应，从而导致细胞毒性

相比之下，EGFR 降解剂会主动去除抑制剂结合的 EGFR 蛋白，从而最大限度地减少抑制剂结合的 EGFR 诱导的压力

事实上，作者发现厄洛替尼和奥希替尼显着诱导 PC9、HCC4006 和 NCI-H1975 细胞中内质网应激下游的关键趋死基因

在E图中，可以看到siRNA抑制EGFR表达后，这种诱导减弱

在F图中，可以看到641这个变构降解剂处理后，这种诱导也减弱。

实验内容的第5部分，激活内质网应激前臂可增强 EGFR 小分子抑制剂的细胞毒活性

激活内质网应激趋死的作用可增强 EGFR 小分子抑制剂的细胞毒活性。为了进一步验证内质网应激在 EGFR 激酶抑制剂功效中的作用，作者提出了以下2个问题：

（1）阻断 ATF4-CHOP 信号传导的诱导是否会赋予对 EGFR 激酶抑制剂的抗性？

（2）内质网应激的药理学诱导是否弥补了 EGFR 降解剂失去的功效？

速合压力反应抑制剂ISRIB 的处理，确实减弱了由 EGFR 激酶抑制剂诱导的 ATF4、DDIT3 和 PPP1R15A 的激活

ISRIB 处理，降低了 PC9 和 NCI-H1975 细胞中的细胞杀伤

相反，在非常低的无毒浓度下添加 ER 应激诱导剂衣霉素或毒胡萝卜素极大地诱导了趋死的内质网应激基因的表达，并增强了降解剂 GNE-104 在 PC9 细胞中的细胞毒性

受这些发现的启发，作者继续探索直接激活整合压力反应是否可以进一步提高临床批准的 EGFR 抑制剂的疗效。

为此，作者转向了 PERK 激活剂 CCT020312，与更广泛作用的内质网应激诱导剂衣霉素相比，它专门激活内质网应激下游的 PERK-ISR 分支。

毒胡萝卜素当与厄洛替尼或奥希替尼联合应用时，CCT020312 进一步增强了厄洛替尼和奥希替尼对 ISR 基因表达的诱导并增强了细胞死亡诱导，

导致几乎完全消除在急性 EGFR 抑制剂治疗后通常保留的残留细胞。

这些结果突出了一种以前未被重视的提高对可能具有临床意义的抗 EGFR 疗法的反应的途径。

整合压力反应基因表达被诱导，增强了细胞死亡