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实验内容的第1部分，四个在 TBK1 中具有纯合功能丧失突变体的个体

作者找到了来自3个家庭的 4 个 TBK1 基因突变的病人。

这张图，是这些病人的情况。

病人1，32岁，女性，来自一个摩洛哥血统的近亲结婚的家庭。她的TBK1基因上，在第619位的色氨酸发生了无义突变，造成了蛋白质的截断突变。而且她是这个突变的纯合子。

病人2，26岁，男性，他是病人1的弟弟。他有和他姐姐一样的纯合突变。

这对姐弟两人都在1岁时发展为多关节炎，随后出现皮肤血管炎、自身炎症特征和轻度智力障碍

病人3，7岁，他是在第212位的酪氨酸变成了天冬氨酸，而且他是这种突变的纯合子。他是来自印度的近亲结婚的家庭。

病人3有与病人1和病人2相似的自身炎症综合征。

病人4，8岁，他是在第440位的精氨酸变成了无义突变，蛋白质产生了截断，而且他是这种突变的纯合子。他也是有自身炎症性疾病，包括反复发烧、关节疼痛、红斑皮疹、生长障碍、 和伴随脑室扩大和脑萎缩的神经认知发育延迟

为了确定遗传变异是否影响 mRNA 表达和/或蛋白质产生，我们从 P1 和 P2 这两个病人中提取了真成纤维细胞， 用hTERT 方法永生化成永生细胞。

hTERT是端粒反转录酶。

我们可以看到永生化后的细胞中，TBK1的mRNA量明显降低于野生型的细胞。

同时，在永生化后的细胞中，P1和P2这两个病人的细胞中测不到TBK1蛋白，而在野生型的细胞中是可以测到有TBK1的蛋白的。

接着，作者把几种突变基因转染进 HEK293T 细胞进行表达。

发现，在转染的这几种突变的基因的mRNA与野生型基因的mRNA差不多。

但是，蛋白的含量差异很大。

Y212D,是一个替代突变，它表达的蛋白的量，与野生型基因表达的蛋白的量是差不多的。

而截断突变的基因，蛋白的量很少。

这是TBK1 突变基因转染的细胞中，信号通路下游基因的mRNA表达情况。

我们可清楚地看到，被突变基因转染的细胞中，IFIT1基因的mRNA含量极低，与此相对应的野生型基因转染的细胞中，IFIT1基因的mRNA含量较高。

IL-6的基因表现出相似的情况。被突变基因转染的细胞，IL-6的mRNA含量很低，与此相对应的野生型基因转染的细胞中， IL-6基因的mRNA含量较高。

实验内容的第2部分，TBK1 的完全丧失并不会让 IFN-I 系统的功能完全丧失

在以往的研究中，发现TBK1是介导免疫反应的重要一环。

敲除了两个TBK1基因，对小鼠是致死的。

但是，作者惊奇地发现，这4名患者都有免疫能力。

P1 病人的神经节中出现钙化点。

接下来，作者把P1和P2病人的端粒酶永生化的B细胞，用EB病毒转染，

接着用poly(I:C),也就是聚肌胞苷酸，和lipofectamine进行转染。这其中聚肌胞苷酸，是一种类似病毒双链DNA的免疫刺激剂，而lipofectamine是一种常用的转染剂。

用这两样东西转染之后，P1和P2两个病人的永生细胞，都表达出了少量的，但是可以检测得到的beta-干扰素，和白介素6.

再往beta干扰素的下游看，IFIT的mRNA表达量与健康人的对照的mRNA可比。

把TBK1 的 Y212D 突变型基因在永生细胞中表达，产生的STAT2和IRF3，会少许多。

这是把Y212D的突变体，依然可以有与野生型相似的下游反应。

这张图，就是多个下游基因的mRNA的表达量。

这是P1和P2的永生化细胞，对pIC刺激的RNA-seq的PCA图

我们可以看到，永生化的细胞在受到内源pIC刺激后，与没有处理过的样品，以及假刺激的样本聚在一起。

而永生细胞受到pIC处理的，聚成另一堆

永生细胞和野生细胞受到pIC和Lipofectamine处理的，聚成第三堆。

pIC的转染，对P1和P2的永生细胞造出一个沉默谱

从图中，我们可以看到这些沉默的基因

这表明 TBK1 无效系统可以通过 RIG-I 样 PRR 和 MAVS 转导信号，但不能通过 TLR3 和 TRIF 依赖途径转导信号。 同时，患者和 HC 之间类似的 ISG 诱导突出了 IFN-I 反应的可塑性，因为尽管细胞因子产生受阻，但抗病毒免疫似乎在很大程度上是足够的

P1 和 P2 中磷酸化和核 IRF3（主要的 IFN-I 转录因子）的存在表明 TBK1 无效系统中的 IFN-I 产生涉及补偿激酶，例如其他非经典 IKK 相关激酶 IKKε

与细胞质 pIC 刺激的 WT 和 TBK1 无效 hTERTs 、EBV-Bs 和 A549s 不同，pIRF3 和 pSTAT2 在 A549s 中不存在，TBK1 和 IKKε 和 TBK1 无效细胞用 TBK1/IKK67307 抑制剂预处理，

此外，dKO A549s 在基线时对 VSV 感染敏感，而 TBK1 KOs 对此不敏感

最后，为了确认丢失的 TLR3 功能是缺乏 TBK1 的结果，作者用慢病毒补充 P1 和 P2 hTERT，从 CMV 或 TETon 启动子驱动 TBK1 表达。在这两种情况下，TBK1 恢复挽救了 TLR3 信号

实验内容的第3部分，与完全丧失 TBK1 表达相比，磷酸化失活 TBK1 对 IFN-I 诱导的破坏更大

重要的是要注意，上述结果并不能调和本论文报告的患者与患有单纯疱疹脑炎的 TBK1 杂合突变个体之间的不同疾病表现。

作者因此要做一个TBK1的突变体，让TBK1蛋白不能磷磷化，看结果会怎么样。

TBK1蛋白主要磷酸化位点，是在它的第172个氨基酸。这个位置原来是一个丝氨酸。

现在，作者做一个突变体，把这个位置做成丙氨酸，也就是做了一个S172A的突变体蛋白。

这个突变体的蛋白没有了磷酸化位点。

作者在P2这个患者的永生细胞中，加入了有S172A突变的TBK1蛋白。

这个突变体，它没有救回TLR3的功能。

但是，他比没有TBK1的系统，更进一步地打乱了IRF3和STAT2，这两个蛋白的磷酸化。

接着，作者检测了S172A这个突变体对于IKKε的影响。

结果发现，S172A型，野生型，或者没有TBK1，这三种形式，对IKK3没有影响。

这提示，S172A立体阻断IKKε对IRF3的MAVS的磷酸化。

在功能上，这种超过完全丧失表达的拮抗 IFN-I 反应表现为 G159A 和 S172A 的细胞内 pIC 刺激后 6 小时对 VSV 病毒的易感性增加，VSV病毒也就是水泡性口炎病毒。

与 S172A 和 G159A 突变相比，P3 的等位基因 (Y212D) 并不明显易受感染，这可能是 Y212D 变体的亚形性（与完全 LoF 相反）的结果，它具有类似的，如果不是稍微好一点的信号 MAVS 介导的通往 TBK1 无效系统的通路的能力

实验内容的第4部分，TNF 驱动的 RIPK1 介导的细胞死亡是 TBK1 缺陷中自身炎症的来源

除了参与 IFN-I 和 NF-kB 激活之外，TBK1 还参与多种其他免疫调节网络。除了在 P1 和 P2 hTERT 中似乎不受影响，并且在 TBK1/IKKε dKO A549s 中仅略微减慢之外，TBK1 还作为重要的肿瘤二级制动器 坏死因子 a (TNF) 诱导的细胞死亡

TNF 受体信号复合物 (TNFR1-SC) 可以通过不同的途径进行传递，这取决于细胞因子与受体结合后募集的下游成分。在大多数情况下，TNF 通过 K63 和 M1 线性泛素化受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1 (RIPK1) 由两种 E3 泛素 (Ub) 连接酶启动促炎和促生存信号：细胞凋亡蛋白 (cIAP) ) 和线性 Ub 链组装复合物 (LUBAC）

然而，受体下游的接头蛋白和二级信使蛋白的平衡可以倾斜，将 TNF 信号转变成细胞死亡诱导事件

如果发生这种情况，细胞死亡将通过细胞凋亡或坏死性凋亡发生。 在这种情况下，被 TNFR 激活的 RIPK1 与 TNFR1-SC 分离，并在一个复合体中募集死亡域蛋白，该复合体可裂解 caspase-8 (CASP8) 以启动细胞凋亡

如果 CASP8 失活，RIPK1 将磷酸化 RIPK3，进而触发混合谱系激酶结构域样蛋白 (MLKL) 寡聚化并在膜中形成孔，从而驱动坏死性凋亡

TBK1 可以通过在 T189 的 RIPK1 上放置一个失活的磷酸盐来抑制这些细胞死亡过程

正是由于这种机制，TBK1 无效鼠细胞比 WT 更容易经历 RIPK1 介导的细胞死亡 (RCD) 以响应 TNF

怀疑细胞死亡率升高可能会导致这些患者的慢性炎症状态，我们测量了 TBK1 缺乏对患者来源的 hTERT 中 TNF 信号传导的影响。FLAG-TNF 的 IP 显示 TNFR-SC 组装了所有参与 NF-kB 激活的成分，而 TNF 刺激时间过程显示在没有 TBK1 的情况下正常靶基因 (IL-6) 诱导（图 3B 和 3C），证明 在没有 TBK1 的情况下，TNF 信号通路的促炎臂的正常功能

然而，TBK1 缺乏对 TNF 诱导的 RCD 的影响是巨大的。CYLD 是一种去泛素化酶，可拆除 RIPK1 和 NEMO 之间的多聚 Ub 链接以增强 RCD 我们发现 CYLD 在 TBK1 无效 hTERT 中比WT 更快地失去其失活磷酸化标记（图 3D）

与抑制 cIAP (birinapant) 和 CASP8 (zVAD) 后的 WT 相比，所有这些破坏的调节最终导致 P1 和 P2 hTERT 中响应于 TNF 的更高的坏死性凋亡率。重要的是，这种效应被 RIPK1 抑制剂 Necrostatin-1 (Nec-1) 挽救了

重要的是，这种效应被 RIPK1 抑制剂 Necrostatin-1 (Nec-1)（图 3E）以及与 WT TBK1 的遗传互补（图 3F）挽救了。与 Y212D TBK1（P3 的突变）或 S172A TBK1 互补产生了 RCD 的部分拯救（图 3G 和 S5B），这意味着即使完全失活的 TBK1，如果表达，也可以提供一些抗 RCD 功能

实验内容的第5部分，TBK1 和 IKKε 通过 CYLD 调节细胞死亡

我们发现转染了 TBK1 和 IKKε 在 293T 过表达系统中磷酸化转染的 CYLD，而激酶死亡的 TBK1-K38A 没有

为了确定 CYLD 对 RCD 调节的贡献，我们发现 Jurkats 中 CYLD 的短发夹 RNA (shRNA) KD 和小鼠耳成纤维细胞中的 CYLD KO 降低了 NEMO 无效细胞中 TNF 诱导的坏死性凋亡的发生率，即使在 MRT 存在下

最后，作者用 RIPK1 抑制剂 Nec-1 完全挽救了 TNF 在 NEMO 无效、MRT 处理、CYLD KD Jurkats 中的坏死性凋亡作用，以确认这都是在 RCD 的背景下

实验内容的第6部分，TBK1缺乏症的体外炎症

TBK1 缺乏症中 RCD 的高发生率代表了这些患者自身炎症的合理来源。作者怀疑 TNF 诱导的细胞死亡的倾向可能会产生免疫刺激损伤相关分子模式 (DAMP) 释放的前馈循环，从而促进持续的炎症反应

与这一假设一致，我们发现了由 CC3 索引的细胞凋亡活动，在 P2 中全局存在，特别是在 P1 的 T 细胞、pDC 和非典型单核细胞中，在全血免疫表型分析中通过多种细胞类型的非特异性炎症特征进行追踪 通过质谱流式细胞术 (CyTOF)。

TBK1 缺乏也对免疫细胞比例产生影响。在 T 细胞区室中，作者发现 P1 和 P2 中激活和扩增的 CD4 和 CD8 效应细胞群，特别是效应记忆 (EM)、CD45RA 重新表达的 EM (TEMRA) 和符合 Th1 分类的细胞

P1 和 P2 中幼稚 CD4 细胞均被耗尽，这可能反映了效应细胞的扩增，而 B 细胞表现出幼稚种群减少以及浆细胞减少

实验内容的第7部分，患者外周血单个核细胞的单细胞 RNA 测序支持细胞死亡并暗示抗凋亡信号

为了更好地了解 TBK1 缺乏症的细胞死亡倾向，我们对来自 P1 和 P2 以及年龄匹配的 HC 的外周血单核细胞 (PBMC) 进行了单细胞 RNA 测序。从患者和对照中整合的 9,833 个细胞的基于图的无监督聚类解决了基于标记基因表达谱以半监督方式注释的 19 个聚类

患者和 HC 之间的差异基因表达分析发现，除了几个核基因（MTRNR2L1、MTRNR2L10、MTRNR2L12）外，患者还表达高水平的线粒体相关基因，这是推定的细胞死亡特征的证据

在细胞类型特异性分辨率下对线粒体基因表达的仔细检查显示，骨髓细胞（单核细胞：1,4、11 和 mDC：13 簇）在患者和 HC 之间的线粒体基因表达升高最大

特别值得注意的是，骨髓细胞内最高的差异表达基因 (DEG) 是核编码的 MTRNR2L1

实验内容的第8部分，抗 TNF 治疗可抑制 TBK1 缺乏症的炎症

对 P1 治疗后血液的分析也表明，她的病情有所改善，大多数异常免疫细胞群处于或恢复到 HC 范围

此外，治疗与各种失调的炎症标志物的平静和整个免疫领域的细胞凋亡活性下降相关