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实验内容的第1部分，小鼠小脑发育的 snATAC-seq 图谱

作者取了从小鼠胚胎的第10天到出生后第63天的小鼠样本，做snATAC-seq后，一共得到91,922个细胞的数据。

每个细胞中包含的片段数量的中位数是20558个片段。

这是这些细胞经过分析得到的UMAP图。

这各个阶段的细胞的相关性图，我们可以看到，

在文库级别，常染色体的CRE有最高的相关性。

其次是来自相邻发育阶段的样本之间有较高的相关性。

经过对细胞的分析，这些细胞被成12个

比照scRNA-seq数据和snATAC-seq数据之间的相关性。可以看到，两者之间有良好的一致性，

对scRNA-seq对细胞分类的结果，与根据snATAC-seq推断出的表达结果做细胞分类的结果的对比。

可以看到，用RNA和ATAC分类的结果高度一致。

早期，也就是E10到E11阶段，主要是祖细胞

中脑起源的细胞和臂旁神经元，它们后来迁移出小脑。

分化的GABA能的深核神经元和谷氨酸能神经元的核过渡区。

从E12开始，谷氨酸能深核神经元可以分解为峡部神经元群，和腹侧群。

在E10-E15期间，祖细胞的相对丰度，从83%下降到17%

从E17到P4阶段，标志是GABA能中间神经元和单极刷状细胞的出现，以及增殖和分化的快速扩张颗粒细胞群，

从E17开始可以检测到少量小胶质细胞和少突胶质细胞，

其中大部分来自小脑外来源。

最后两个阶段，P14和P63阶段，以戌熟颗粒细胞为主。另外的神经元和神经胶质细胞群是可追踪的，包括成熟星形胶质细胞，如伯格曼胶质细胞、和实质星形胶质细胞。

实验内容的第2部分，小脑细胞类型的顺式调控景观

为了表征小脑细胞类型的调节特征，作者采用了簇特异性和复制感知峰值调用方法。

用这个办法，作者确定了261,643个高可信度的推定的CRE。

其中51%是基因的内含子，26%是位于基因间的位置。

这些推定的CRE覆盖了约80%的后脑发育过程中活跃的增强子，包括E11.5后脑中97%的实验验证过的元素，以及82%的增强子RNA在发育中的小脑中转录，

与非神经元组织中活跃的异染色质或增强子相比，这是一个显著的富集。

与成年小鼠器官的单细胞ATAC-seq图谱的比较，揭示了小脑细胞中推定CRE的最高活性。

作者根据与启动子可及性和基因评分的相关性，将 32,792 个远端 CRE 分配给 5,766 个假定的靶基因

CRE-基因对在神经祖细胞中更经常地共享相同的拓扑相关域 (TAD，topologically associating domain) 

在后脑中富含增强子活性，并在发育中的小脑中显示启动子转录物和 eRNA 之间更高的相关性

尽管大多数基因与单个远端 CRE 相关，但 1,001 个蛋白质编码基因被分配到十个或更多元素。

这些基因在发育过程中富集，包括：细胞命运承诺，神经元分化，以及成熟的神经元功能，如突触组织和信号传导。

为了描述小脑发育过程中 CRE 活动的模式，作者使用了迭代聚类程序。

26 个 CRE 集群中的大多数是细胞类型和时间特定的，而一个显示组成型活动。

这些 CRE 簇中的大多数（67%）对应于启动子。

在剩余的远端 CRE 中，超过 50% 包含 CTCF 基序，这表明结构角色，与对人类的观察一致

作者进一步观察到在多种早期出生的神经元类型（簇 2、11）、神经胶质群（簇 18）和晚期出生的细胞类型（簇 14）中活跃的 CRE 组，证实相当大一部分 CRE 具有多效性活动。

细胞类型特异性簇中的 CRE 接近相关 GO 的基因。

例如，少突胶质细胞特异性 CRE 的髓鞘形成

并且富含已知在相应细胞类型中活跃的 TF 基序

例如，ATOH1 对应于颗粒细胞，SOX 家族 TF对应于祖细胞 ，PU.1对应于小胶质细胞

通过鉴定 50,815 个有显著更高活性的差异可访问 CRE 来改进分析

发现的一些不同状态根据发育阶段将细胞与相同的细胞类型区分开来

例如，出生前和出生后的颗粒细胞祖细胞、P14 和 P63 成熟颗粒细胞

作者在产前和产后颗粒细胞祖细胞之间检测到 3,988 个差异可及的 CRE

出生后可访问性增加的 CRE 富含 NFI 基序，已知指定晚出生神经元和 GLI2，与出生后 SHH 介导的颗粒细胞祖细胞池扩张一致。

可访问性降低的 CRE 丰富了标记胚胎祖细胞的图案，如SOX、MEIS

实验内容的第3部分，祖细胞异质性反映细胞命运决定

这是21,830个星形胶质细胞的 UMAP 图。

其中，A图是用细胞亚类来分的，

B图是用发育阶段来分的

C图是用小鼠的性别来分的。

作者要了解这种细胞命运规汇聚模式是否与小脑祖细胞之的异质性有关。

这是每个阶段的4个标志基因的热图。

这是基于选取的标志基因的原位杂交的结果

估计发育中的小鼠小脑（右）中星形胶质细胞类型的定位。

显示了用 HP Yellow (E11-P4) 或 Nissl (P56) 复染的矢状截面。

早期（E11、E13）祖细胞群位于第 4 脑室旁边，而晚期（E18、P4）双能祖细胞和胶质生成祖细胞分别迁移到预期的白质和发育中的浦肯野细胞层 。

这是整个发育阶段底部的相对丰度和顶部中的总体分数

E13-E15 的标志是两个晚期祖细胞种群的出现，它们大致对应于先前描述的双能 (Gsx1、Wnt8b) 和神经胶质细胞 (Slc1a3、Grm3) 祖细胞。

作者在围产期（E15-P7）检测到两组分化的实质星形胶质细胞：白质（Slc6a11、Olig2、Kcnd2）和颗粒细胞层（Aqp4、Tekt5）星形母细胞，CRE活性与双能祖细胞和胶质祖细胞具有更高的相似性， 

然后作者研究了两个Gsx1+种群、早期前室区祖细胞和晚期双能祖细胞的关系。

除了额外的共享标记基因（Wnt8b、Ndnf、Robo1）外，E10-E12 前室区祖细胞与 E13-E15 双能祖细胞在阶段匹配的祖细胞类型中显示出最高的 CRE 活性相似性

以前，Gsx1 + 祖细胞被证明是由产生浦肯野细胞的心室区祖细胞的时间转变引起的。作者的数据支持存在额外的、分子上不同的、早期祖细胞的前群，它们已经准备好获得双能祖细胞的身份。

祖细胞主要按发育阶段而不是按生发区聚集，

表明其染色质可及性在发育过程中发生了强烈变化。这些时间差异在早期胚胎阶段（E10-E12）最为明显，这一时期与不同神经元细胞类型的连续产生相吻合。

跨祖群和发育阶段的 CRE 活动的无偏聚类揭示了许多在生发区之间共享的时间动态 CRE

争夺控制祖细胞能力时间转变的共同因素

为了评估染色质可及性的这些时间差异是否也会导致基因表达的变化，作者系统地确定了在发育阶段之间比在生发区之间具有更高方差的基因。

令人欣慰的是，Gsx1和Gdf10等标记基因在整个生发区中表现出更高的差异

然而，E10-E13 中的 2,000 个高度变异基因中的大多数在整个发育阶段表现出更高的方差，而 E15-P0 中祖细胞类型的方差更高。与作者的聚类分析一致

时间变异基因（E10-E13 中 310 个，E15-P0 中 61 个）包括多能性因子Lin28a。

它在所有生发区的 E10 祖细胞中表达，以及Nfix，在发育过程中表达增加，与晚期 CRE 簇中 NFI 基序的富集一致

实验内容的第4部分，神经元分化过程中的调节活动

作者对数据集中三种最丰富的神经元类型分化的基因调控程序进行了表征：颗粒细胞、浦肯野细胞和中间神经元。

对于每种神经元类型，作者将来自不同发育阶段的细胞沿着它们的分化轨迹对齐，使用扩散伪时间对其进行建模

观察到的分化动力学范围从阶段限制（浦肯野细胞，E12-E13）到长期（颗粒细胞，中间神经元），与颗粒细胞和中间神经元的数周长生成一致

虽然颗粒细胞形成同质的分化群体，中间神经元被分为不同的时间指定亚型。

在 E13-E15 检测到的早期中间神经元，Zfhx4, Slit2

中期出生的高尔基细胞、和浦肯野层中间神经元普遍存在于 E17-P7。高尔基细胞的标志基因是Chrm2, 浦肯野层中间神经元的标志基因是Klhl1

晚期出生的 1 型和2型分子层中间神经元，在P14到P63期丰富。1型的标志基因是Sorcs3和Crm8, 2型的标志基因是MLi2，Nxph1, Pvalb

这是颗粒细胞、浦肯野细胞、中间神经元，这三种细胞的的动态活性TF

这是浦肯野细胞、颗粒细胞的关键基因调控的轨迹。

这是三种神经元，观察到的从接近胚胎发育和细胞命运承诺相关基因的CRE逐渐过渡到在神经元分化、迁移和轴突引导中起作用的基因，并最终形成突触、神经递质分泌和离子运输。

根据在发育中的新皮层中的观察，为了支持生物过程中的这种融合，至少有两种神经元类型共享 43% 具有跨假时间动态活动的蛋白质编码基因。

相比之下，相比之下，只有 20% 的动态 CRE 在神经元类型之间共享（即多效性），进一步突出了与基因表达相比基因调控的细胞类型特异性。

多向性 CRE 在神经元类型中表现出相似的活动特征，

多向性 CRE 的活动特征神经元分化早期阶段更常见

实验内容的第5部分，CREs 在小脑发育中的进化动力学

据报道，随着发育的进展，整个器官的基因调控和表达保守性下降

鉴于发育过程中细胞类型丰度的深刻变化，目前尚不清楚整个器官模式是由于跨细胞类型的保守性平行下降而出现的，还是反映了早期阶段更丰富的细胞类型（例如祖细胞和早期细胞）的更高保守性。

这张图是用小鼠和16种不同的脊椎动物，进行同线序列比对，评估了对 CRE 序列的选择性（功能）约束，推断它们的首次出现的时间。

通过根据分化状态（假时间）和发育阶段对颗粒细胞进行分层，作者观察到这两个因素都导致发育过程中基因间 CRE 保守性的降低，处于早期分化状态和发育阶段的细胞显示出最保守的调控程序

尽管这些细胞的整体高度相似，但作者确定了具有显着时间活动变化的 CRE，并将它们分为两组，在产前阶段的可及性减少 (7,527) 或增加 (11,972)。

可及性降低的 CRE 更保守，富含多能性 TF 识别的基序（例如 SOX2），而可及性增加的 CRE 富含颗粒细胞祖细胞中活性的 TF 基序，包括 ATOH1 和 GLI2

一致地，在颗粒细胞祖细胞的发育阶段中可及性降低的 CRE 更保守，并且在其他类型的祖细胞和早期分化细胞中更活跃，而可及性增加的 CRE 对颗粒细胞祖细胞具有特异性

实验内容的第6部分，不同细胞类型的 CRE 约束差异

作者还观察到细胞类型之间基因间 CRE 保守性的差异。与所有其他小脑细胞类型相比，在小胶质细胞中活跃的 CRE 显示出更快的进化周转

与小胶质细胞基因表达和形态的快速分化一致

相比之下，星形胶质细胞（祖细胞和星形胶质细胞）在成熟小脑中显示出最保守的基因间 CRE。

我们发现星形胶质细胞具有最保守的基因间 CRE，不仅在成人小脑中，而且在所有成人器官中。此外，所有器官中十种最保守的细胞类型中有八种是神经细胞。突出了大脑中整体更强的进化约束

实验内容的第7部分，整个哺乳动物的 CRE 活动保护

为了评估对序列约束的观察是否扩展到 CRE 活动保守性，作者检查了灰色短尾负鼠中小脑细胞的染色质可及性，这是一种通过约 1.6 亿年的进化与小鼠分离的有袋动物。

19,204 个负鼠细胞的 UMAP 投影，按样本或细胞类型和状态，进行着色

在相应阶段检测到与小鼠小脑相同的细胞类型，具有相似的丰度和许多共享的标记基因。作者确定了 167,340 个假定的 CRE，并将它们与基于互惠同线比对的小鼠 CRE 进行了比较

近 50% 的具有保守序列的小鼠 CRE 也显示出保守的活性，远端 CRE 的进化速度比启动子快。

事实上，与改组的同源对相比，直系同源的基因间 CRE 在匹配的细胞类型和发育阶段之间的活性显着更高的相关性