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文章的题目是《Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice》文章发表在Nature杂志的2021年6月刊上。

文章的题目，翻译成中文，意思是《造血干细胞的基础编辑挽救了小鼠的镰状细胞病》

文章的通讯作者，是David R. Liu，他的中文名是刘如谦。他是一个美籍华裔，他的父母是移民到美国的台湾人。Daivd Liu是哈佛大学化学与化学生物学教授。

这里，我们介绍一下David Liu的碱基修改方法中的第一个原理，如何从A碱基变到I碱基。

David Liu开发了一种腺苷脱氨酶，

图中左边，是正常的A碱基，

在腺苷脱氨酶的作用下，A碱基可以被脱掉一个氨基，

转变成了一个I碱基。这个I，也就是Inosine，中文意思是“肌苷”

肌苷有一个特点，就是它会被DNA聚合酶读当成是G碱基来读，也就是聚合酶会在它的互补链上，加上一个C碱基。

再说David Liu的方法中的第二部分，在基因组的特定位置把A碱基变到I碱基，再从I碱基变到G碱基。

这里，先用Cas9与腺苷脱氨酶结合，

Cas9在sgRNA的作用下，起到在基因组上定位的作用。

腺苷脱氨酶，把目标A碱基，经过脱氨，变成I碱基。

DNA双链中，I碱基所在链的互补链，被缺口酶剪开一个缺口，当缺口平移修复时，DNA聚合酶会把I碱基识别成G碱基，在互补链上合成一个C碱基。

互补链上的C碱基，再经过DNA复制，这里的I碱基就被替换成G碱基。

这样，就把原来目标位置上的A碱基替换成了G碱基。

作者把这个方法，叫作Adenine base editor，缩写是ABE，A碱基编辑器的意思

实验内容的第一部分，在造血干细胞和祖细胞中对HBBS 基因做碱基修改

图中，展示了镰刀贫血的HBB S突变、和无害的Makassar型。

其中，镰刀贫血，它的β珠蛋白基因的第7个氨基酸，是一个缬氨酸。它的反义链上，密码子是CAC。

如果能把反义链改一个碱基，改成CGC，那么对应的氨基酸就会变成甘氨基。也就是变成Makassar这种基因型。而Makassar这种基因型是一种无害的基因型，Makassar这个基因型的蛋白，也被称为HBB G型，或者beta G。

作者的ABE方法，目标就是为这个目标A碱基，转变成G碱基，把致病的突变，转变成无害的突变。

在目标A碱基的旁边，还有几个A碱基。这几个A碱基，存在被A碱基编辑法转变成G碱基的可能性。

作者把这些变化的可能性也标了出来。

可以看到，A9这个碱基，如果被改成G碱基，它翻译出来的氨基酸还是脯氨酸，蛋白的序列不发生改变，所以这是个沉默突变。

A12这个碱基，也是同样，被改成G碱基后，翻译出来的氨基酸还是苏氨酸。

而A16这个碱基被改成G之后，翻译出来的氨基酸是脯氨酸，与原来的亮氨酸是不一样的。

这是用核糖核蛋白、或mRNA，结合sgRNA的修改效果，被修改的是有镰刀贫血的人的造血干细胞和祖细胞。

可以看到用mRNA和sgRNA用电穿孔，目标的A7这个位置有80%左右的编辑效率，A9会有70%的沉默突变，外加少量的一些indel突变，和错义突变。

用核糖核蛋白加sgRNA，用电穿孔方法，可以看到，目标的A7有约44%左右的编辑效率，A9会有30%多的沉默突变，外加少量的一些indel突变和错义突变。

这是用液相色谱来分析被碱基修改的病人患者的红细胞前体，来看表达的各种珠蛋白的比例。

在没被碱基修改的样本中，βS占了87%。其余是 δ,占了3%，还有gamma G占5%,和Gamma A占4%,

在被用mRNA碱基修改的样本中，β G占了76%，β S只占了14%，

在被用RNP碱基修改的样本中，βG占了52%，βS点了37%

这说明，随着对β珠蛋白基因的碱基修改，导致产生了大量的βG蛋白，而βS蛋白相应大量地减少。

接着，作者在2%的氧气中培养了碱基修改后的网织红细胞，同时用没有经过碱基修改的网织红细胞作为对照组。

这里，2%的氧气压力，是明显低于正常大气中的20%的氧气压力的。一般情况下，低氧压的时候，有镰刀贫血的红细胞更容易变成镰刀的形状。

我们看，没有被碱基修改过的样本中，也就是S/S型中，大量地出现了变形的红细胞。

而在正常的、没有基因突变的样本中，也就是A/A型中，红细胞都基本维持了正常的圆形。

而在被用mRNA碱基修改过的突变样本中，出现了少量的镰刀形红细胞；

在被用RNP碱基修改过的突变样本中，也出现了少量的镰刀形红细胞。

右边的柱状图，是量化的镰刀状的红细胞的比例。

可以看到，两种经过碱基修改的样本，出现的镰刀状红细胞的比例，都大大低于没有被碱基修改的样本中出现的镰刀状红细胞的比例

实验内容的第二部分，全基因组的脱靶情况

碱基修改中，最严重的副作用是发生脱靶的碱基修改。

作者先是用Cas-OFFinder这个软件，在人的全基因组中找可能发生脱靶的碱基修改的位置，寻找的条件是与用的碱基修改的引导序列的错配的碱基少于或等于3个碱基。

Cas-OFFinder软件是找到了140个符合这个条件的基因位点。

作者再用CIRCLE-seq方法来找基因位点，找了601个位点。

Cas-OFFinder和CIRCLE-seq方法，两者找到的位点中，交叠的是16个位点。

作者用多重靶向DNA测序方法对被碱基修改的样本做脱靶检测。

找到54个突变位点。

这54个位点，都属于CIRCLE-seq找到的位点。

这54个脱靶的突变中，

有4个是落在外显子的位置，但都只是沉默突变。也就是说这4个突变都不改变蛋白的序列。

一个突变落在CCDC85B基因的启动子区。

其它的突变落在非翻译区，或者基因间的区间。

实验内容的第三部分，将人的造血干细胞植入到小鼠中

这是把镰刀贫血病人的造血干细胞，经过碱基修改后，输给小鼠的过程。

先是把病人的造血干细胞培养48小时，

接下来，用电穿孔的方式进行碱基修改，

24小时后，把这些细胞通过尾声静脉注射，移植到免疫缺陷型的小鼠身上。

注射后16周，当持续的人类细胞被认为是从能够维持造血系统骨髓再增殖造血干细胞产生时，从小鼠中提取骨髓进行分析。

为了确定碱基修改对造血干细胞在小鼠体内存性的影响，作者对小鼠的骨髓中的造血细胞，用流式细胞仪做分析，用抗人的CD45抗体来进行荧光显示。

图中，左边的这些点是没有经过碱基修改的人的细胞，

右边是经过碱基修改的人的细胞，可以看到，两者在小鼠体内的含量，都是70%左右。没有大的差别。

接着，用流式细胞仪来检测小鼠骨髓中，人类白细胞中的各个亚细胞种类含量

分别用抗人CD19来检测B细胞，用抗人CD33来检测髓细胞，用抗人的CD3来检测T细胞，

左图中，可以看到，白细胞的各个亚细胞群的含量，在没有经过碱基修改，和经过碱基修改之间，没有什么差别。

类似的，在右图中，是用CD235a来检测红细胞，看人类的红细胞在所有的红细胞中的占比，可以看到，没有经过碱基修改的，和经过了碱基修改的，含量没有什么差别。

接下来，作者想搞清楚，碱基修改是否有导致偏态造血的可能性。

作者用针对人类的几种抗体来纯化供体的几种单核细胞，然后，用高通量测充来看其中的经过碱基修改的比例。

可以看到，这几种单核细胞中经过碱基修改的，都是在68%左右的比例。

一方面，各个亚细胞群中的经过碱基修改的细胞的比例都较相似。另一方面，比植入前的80%是有略有下降的。这可能反映了输入的混合细胞中，非再生的细胞的编辑效率略高，而在再生的造血干细胞中是68的编辑效率。

这是两只被移植了人的、经过了碱基修改的造血干细胞的小鼠，从小鼠的骨髓中分离出的人的细胞，再检测这些人的细胞的被碱基修改的情况。

图中，三种颜色，分别代表了这些细胞中被编辑了的基因的拷贝数。

深蓝，是两个基因拷贝都被修饰了，浅蓝是一个基因拷贝被修饰了，灰色是两个基因拷贝都没有被修饰。

看平均数，平均40.6%的细胞中，有两个基因被修饰；

是平均46.5%的细胞中，是有一个基因被修饰；

平均12.9%的细胞，两个基因都没有被修饰。

这是两只被移植了人的、经过了碱基修改的造血干细胞的小鼠，从小鼠的骨髓中分离出的人的细胞，再检测这些人的细胞的被碱基修改的情况。

图中，三种颜色，分别代表了这些细胞中被编辑了的基因的拷贝数。

深蓝，是两个基因拷贝都被修饰了，浅蓝是一个基因拷贝被修饰了，灰色是两个基因拷贝都没有被修饰。

看平均数，平均40.6%的细胞中，有两个基因被修饰；

是平均46.5%的细胞中，是有一个基因被修饰；

平均12.9%的细胞，两个基因都没有被修饰。

这是β珠蛋白的各种形式，在被编辑过的细胞中占比，

可以看到，其中βG的形式占了58±2.8%

而在没有被编辑过的细胞中，没有检测到βG的形式

这是在被碱基修改过，和没有被碱基修改过的细胞中，镰刀状红细胞的占比。

右边量化的图中，可以看到，经过碱基修改的红细胞中，镰刀状的细胞的比例，

下降到了没有被碱基修改过的细胞中的1/5

实验内容的第四部分，把碱基修改过小鼠的造血干细胞移植到镰刀贫血小鼠体内

把人类的造血干细胞移植到小鼠射上，会面临一个困难，就是人类的细胞在小鼠身上活不了太久。

为此，作者对小鼠的细胞做基因改造，来做移植实验。

作者先把小鼠的内源基因做基因改造，把小鼠的内源alpha珠蛋白基因和beta珠蛋白基因都换成是人类的基因。

被换了基因的小鼠，

还分成beta珠蛋白基因是SS纯合型的，

或者是A/S杂合型的。

其中，beta珠蛋白基因，是S型和A型的杂合型的，这种小鼠是无症状的。

作者把S型纯合基因的小鼠的造血干细胞，一部分做碱基修改，另一部分不做碱基修改，分别注射到受辐照的成年受体小鼠中。

再把杂合型基因的小鼠的造血干细胞，注射到受辐照的成年小鼠中。

说明一下，供体小鼠细胞表达CD45.2, 而受体小鼠细胞表达2D45.1,因此，可以用专门的抗体把供体和受体这两种小鼠细胞区分开。

移植之后，通过分析受体小鼠体内的含CD45.2的细胞,可以确定受体小鼠体内90%以上的红细胞是来源于供体的细胞。

图中，是植入后的情况，基因修改过的与没有基因修改过的造血干细胞，和A/S型供体组的造血干细胞，三种细胞在受体内的进展情况相似。

这张图是碱基修改的效率，

左侧的柱子，是电穿孔后3天，也就是移植前，测量到的从S到G的编辑效率是53± 4.5%

右侧的柱子，是移植后16周，小鼠全血基因组DNA的编辑水平，显示G等位基因的频率是44 ± 11%

这是小鼠在被处死后，骨髓细胞集落的克隆分析，显示的等位基因被编辑的情况。

40±15% 的细胞在2个S等位基因中，都被编辑。

36±12%的细胞，在1个等位基因中，被编辑。

24±3.2%的细胞，2个等位基因，都没有被碱基修改。

为了测量碱基编辑对循环红细胞中血红蛋白组成的影响，作者分析了每个时间点的外周血细胞裂解物。

平均来说，在接受了基因编辑后的细胞的移植后，小鼠中，beta G蛋白，占总beta样珠蛋白的75-82%。

而且，在整个实验过程中，几乎没有波动。

这里，血红蛋白中，beta G的含量是约79%，而beta G这个等位基因在基因水平上的含量是44%，蛋白含量高于等位基因的含量，估计是因为含了beta G蛋白的红细胞的寿延长。

这是在移植后第14周，从小鼠中抽取血液，使用Hemox Analyzer在氧压的连续下降梯度上测量血红蛋白氧合，以评估HBB S to HBB G编辑导致血红蛋白-氧结合的改变。

结果是，三种情况氧压没有什么改变。

实验内容的第五部分，用移植的方法救治镰刀贫血的小鼠

作者对四种情况的小鼠的情况进行分析。

这四种情况的小鼠，分别是：

1、被移植了没有经过碱基修改的S型纯合子的造血干细胞

2、被移植了经过碱基修改的S型纯合子的造血干细胞

3、被移植了S型杂合子的造血干细胞

4、没有被移植，本来就是S型杂合子的小鼠

这里被检测的第一个指标，是血红蛋白含量。

我们可以看到，第一类小鼠的血红蛋白含量较低，约为9左右。

第二类到第四类小鼠，血红蛋白的含量都在约11左右。

这张图，是四种情况的小鼠体内的网织红细胞。网织红细胞，就是不成熟的红细胞。

可以看到，第一种情况下，网织红细胞特别高。

其它三种情况，网织红细胞的含量都相对较低。

这是四种情况的小鼠体内的红细胞与白细胞的情况。

可以看到，第一种情况，红细胞计数明显偏低。

同时，第一种情况，白细胞计数明显偏高。

把上面4张图放在一起，我们可以看到，经过碱基修改的HBBS/S造血干细胞的移植，救了有基因缺陷的小鼠，让被治疗的小鼠的这四项血液参数，都恢复到了与健康对照组相似的水平。

这是三种小鼠的血细胞的形状，

可以明显地看到，接受没有经过碱基修改的造血干细胞的移植的小鼠，血液中有大量的镰刀状红细胞。

而接受经过碱基修改的造血干细胞移植的小鼠，镰刀状红细胞的数量要少许多。

当然隐性携带小鼠，镰刀状红细胞的数量是最少的

脾脏肿大是年轻的镰刀贫血患者的的标志性症状，也是患镰刀贫血的小鼠的特征。

这是三种小鼠的脾脏的大小尺寸。

可以清楚地看到，接受S型纯合子的移植的小鼠，脾脏体积最大

接受基因修改的细胞的移植的小鼠，脾脏尺寸较小。

而对照组的小鼠的脾脏尺寸是最小的。

实验内容的第六部分，二次移植剂量依赖性抢救

作者为了搞清，基因编辑后造血干细胞重新再生的，并拯救镰刀贫血的效果，进行二次移植。

这张图，是二次移植的操作流程。

首先，是已经经过了一次碱基修改的镰刀贫血细胞移植的小鼠，这个小鼠现在已经有39%的G型的等位基因频率了。

另一组，是经过了移植没有被碱基修改的镰刀贫血细胞的小鼠。当然这个小鼠身上全都是S型的等位基因了。

把这两组小鼠的骨髓，按一定的比例进行混合，

混合好之后再注入被辐照过的小鼠体内。

这里，混合的比例分别是0:100，20:80，40:60，80:20，100:0.

二次移植后16周，作者收集外周血，对移植的效果进行评估。

这是二次移植后，移植的三项直接指标的情况。

我们可以看到，b图中，是显示PBMC中有多少是移植进来的细胞。可以看到，90%以上，都是移植进来的细胞。

接着看c图，是G等位基因的比例，这个和预期一致，原来掺的被碱基修改过的细胞的比例越高，后面被测到的G等位基因的比例也就越高。

再着d图，G的蛋白的比例，也同样，原来掺的G的基因多，后面测到的G的蛋白也就多。

这是二次移植后，几个血液指标。

我们可以看到，e图中，是血红蛋白中G亚型的占比和血红蛋白绝对含量的关系，我们可以看到G亚型的占比是和血红蛋白的绝对含量呈成正相关的。

F图，是G亚型蛋白的占比，和网织红细胞的占比的关系，我们可以看到，这两者之间是负相关的，也就是G亚型的占比越高，网织红细胞的占比就越低

G图，是G亚型蛋白占比与红细胞数的关系，可以看到两者是正相关的关系

H图，是G亚型蛋白占比与白细胞数的关系，可以看到两者是负相关的

实验内容的第七部分，Cas9 核酸酶和 ABE 处理的影响

检测CDKN1的表达，可以监控P53介导的DNA损伤反应。

作者用数字PCR的方法测CDKN1的表达，来监控用Cas9核酸酶或者ABE处理后，引起的损伤反应。

图中，横轴是处理后的时间，纵轴是CDKN1的mRNA表达量

红色折线是Cas9处理后的CDKN1的表达，

黑线是没有载体单纯电穿孔的效应，

蓝线是ABE处理的结果，灰色线是没有被电穿孔的阴性对照。

可以看到红线代表的Cas9的处理，引起了很高的损伤反应，6个小时后是单纯电穿孔反应的2.7倍，48小时后是4.8倍。

而ABE处理，结果是与单纯的电穿孔的效应是差不多的。

这张图，展示了ABE处理、或Cas9处理，分别会引起的基因突变。

可以看到，ABE处理，主要是发生单碱基的修改，很少有indel发生。

而Cas9处理，会在BCL11A这个基因处引发大量的indel

作者进一步查了ABE是否会引起HBB基因的拷贝丢失。

实验结果证实，ABE没有引起HBB基因的拷贝丢失。

相比之下，Cas9核酸酶引起了很明显的BCL11A基因的等位基因丢失。